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Regolazione dellEspressione Genica Puo essere regolata in una delle seguenti sei fasi: DNA RNA transcript mRNA inactive mRNA protein inactive protein NUCLEUSCYTOSOL.

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Presentazione sul tema: "Regolazione dellEspressione Genica Puo essere regolata in una delle seguenti sei fasi: DNA RNA transcript mRNA inactive mRNA protein inactive protein NUCLEUSCYTOSOL."— Transcript della presentazione:

1 Regolazione dellEspressione Genica Puo essere regolata in una delle seguenti sei fasi: DNA RNA transcript mRNA inactive mRNA protein inactive protein NUCLEUSCYTOSOL trascrizioneMaturazionetrasporto traduzione degradazione controllo dellattivita

2 Metodi per studiare lespressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

3 Purificazione dellRNA Procedura – Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi – Rimozione delle proteine – Precipitazione specifica dellRNA

4 Northern blot Per determinare la dimensione e la quantita di specifici mRNA Studi sullespressione genica

5 Northern blot – Elettroforesi dellRNA in gel contenente formaldeide per mantenere lRNA in forma completamente lineare – Trasferimento dellRNA su una membrana – Ibridazione con una sonda marcata

6 100V0,2A +- generatore di corrente gel di agarosio scatola elettroforetica tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

7 Gel Elettroforesi- Separa le molecole in base alla dimensione

8 Trasferimento su supporto solido

9 Trasferimento dal gel alla membrana

10 gel membrana Dopo il trasferimento

11 Preparare la sonda per il Northern Blot

12 Ibridazione La sonda marcata e aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega lRNA da analizzare

13 Lavaggio Rimozione della sonda non legata al supporto solido

14 Rivelazione degli ibridi Esposizione di un film se la sonda e marcata radioattivamente Se la sonda e marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

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16 Northern blot La rivelazione avviene usando: – DNA marcato con radioattivo( 32 P) – DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

17 Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves ( L ), germinating seeds ( Se ), roots ( Ro ) and stems ( St ). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 ( top panel ) and ElLTP2 ( middle panel ). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb Northern blot

18 Svantaggi del Northern Blot Richiede grandi quantita di RNA E un processo lungo e laborioso

19 AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

20 Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita di una specifica sequenza di DNA in vitro Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte PCR: reazione polimerasica a catena

21 ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

22 IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO 2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72°C E OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

23 PCR: Reazione a catena della polimerasi Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

24 PCR: Reazione a catena della polimerasi

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26 PCR: amplificazione n.ro cicli n.ro sequenze bersaglio La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers Occorre ~1 g di DNA per lanalisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.

27 PCR VANTAGGI: Sensibilita Rapidita Si presta allanalisi simultanea di molti campioni (high throughput) Si presta allanalisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione Si presta allanalisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato SVANTAGGI: Sensibilita (rischio di contaminazioni-falsi positivi) Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Può sintetizzare frammenti relativamente corti La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3->5 esonucleasica)

28 Esempi di utilizzo della PCR Su DNA: –segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA –Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da clonare Su RNA messaggero (RT-PCR): –segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi) –Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da clonare - isolare cDNA specifici per determinati geni.

29 Trascrittasi Inversa-PCR Rivelazione di mRNA molto rari Analisi di RNA con pochissime quantita

30 Procedura Purificazione dellRNA Aggiungere i primer mescolare RNA con la trascrittasi inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

31 AAAAA5 TTTTT Primer reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) AAAAA TTTTT mRNA cDNA mRNA Remove RNA (RNase A) TTTTT 5´cDNA Add PCR primers Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR) TTTTT Primer 2 Primer Add Taq polymerase. Run PCR

32 RT-PCR semi-quantitativa: Selezione del numero di cicli necessari per trovarsi nella fase di amplificazione esponenziale Number of molecules Number of cycles

33 RT-PCR in tempo reale Utilizza particolari combinazioni di coloranti fluorescenti la cui fluorescenza viene smascherata quando la catena di DNA viene sintetizzata oppure che vengono intercalati nella catena nascente durante la reazione di amplificazione. Lutilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza

34 Polymerase Chain Reaction: resa Resa teorica: 2 n P=(2) n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza Log[DNA] N° cicli termici Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile

35 Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

36 RT-PCR quantitativa Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR Rilevamento della fluorescenza associata allamplificazioneRilevamento della fluorescenza associata allamplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

37 Analisi tramite software

38 La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche. Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time per PCR Real-Time

39 SYBR Green I SYBR Green: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

40 Allinizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente SYBR Green

41 Dopo lannealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

42 SYBR Green Durante lelongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dellamplicone

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44 l l se r st l se r st pl RT Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR) Epoxide hydrolase

45 Ibridazione dellRNA in situ Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T7/T3 or SP6 promoter

46 Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root RNA in situ hybridization Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate (BCIP)

47 Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare lattivita

48 Il saggio di run-on permette di determinare il livello di trascrizione di un gene 1)Purificare i nuclei 2)+ NTP, 32 P GTP 3)Trascrizione: la catena nascente e radioattiva 4)Estrazione dellRNA 5)Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

49 Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici analizzata tramite run-on Lodish Figure 10-23

50 Northern blotting Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP RNA isolation AAAAAA Gel electophoresis Blotting Hybridization Autoradiography

51 reverse Northern blotting Northernreverse Northern

52 cDNA arrays (continued) macro-arrays –low-density –filter-supported –radioactive probes (duplicates) –low sensitivity –only cDNA clones spotted –cheap

53 cDNA arrays (continued) micro-arrays –high-density –glass-supported –fluorescent probes (single slide) –high sensitivity –ability to spot oligonucleotides –very expensive

54 Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene. I microarrays In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per listologia.

55 Microarray technology Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo linking Probes

56 si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti. E necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni. Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays

57 Arrays Probe DNAs are spotted onto a glass slide Each spot corresponds to a particular gene e.g. β-actin Each array will have thousands of spots (typically 3000 to 30000)

58 Targets RNA is extracted from tissues or cells testreference mRNA cDNA RNA is copied to DNA labelled DNA is fluorescently labelled pooled Samples are pooled

59 Hybridisation Labelled target DNA hybridised to array Fluorescence of each spot indicates how much of particular RNA was present in both samples

60 Data Processing Hybridised Array Images Scanner Ratios Spot-finding Normalisation Normalised Ratios Further analysis

61 Cy5 Cy3 Cy3 Cy5 testreference

62 Spot-finding (1) Software identifies grid of spots and maps individual spot locations

63 Estrazione dellmRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare Conversione in cDNA Marcatura con 2 fluorocromi diversi Riconoscimento tra i cDNA Eccitazione della fluorescenza tramite laser Immagine a colori raffigurante il microarray provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray (1) (2) (3) (4) (5) (6) Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi

64 STUDIO DEI PROMOTORI: siti di legame dei fattori di trascrizione EMSA

65 Trans Factor Methods: EMSA

66 Electromobility Shift

67 Trans Factor Methods: Consensus Sequence Capture

68 Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine anticorpo

69 Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine Lodish Figure 10-7 Competizione con stesso sito, sito analogo, sito mutato Identificazione dei fattori coinvolti tramite supershift con anticorpi

70 Il footprint con DNasi I permette di localizzare il sito di interazione tra proteina e DNA Lodish Figure 10-6


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