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P P = macromolecola con n siti di legame identici e indistinguibili X X = legante (ioni, piccole molecole,..) A p= 1 atm, T = costante vi sono n equilibri:

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1 P P = macromolecola con n siti di legame identici e indistinguibili X X = legante (ioni, piccole molecole,..) A p= 1 atm, T = costante vi sono n equilibri: P + X PX PX + X PX 2 PX 2 + X PX 3 PX i + X PX i+1 PX n-1 + X PX n

2 A cui sono associate n costanti di equilibrio: Lequilibrio: P + jX PX j

3 Generalmente le concentrazioni delle singole specie PX, PX 2, PX 3,… non sono sperimentalmente determinabili, mentre è possibile determinare la concentrazione delle specie polimero legato (Σ i [PX i ]), polimero non associato [P] e molecole di legante libero [X]. β = numero medio di siti occupati

4 Esempio: n=4 (Emoglobina, Hb) [siti occupati] = [PX] + 2 [PX 2 ] + 3[PX 3 ] + 4[PX 4 ] = = [HbX] + 2 [HbX 2 ] + 3[HbX 3 ] + 4[Hb 4 ] [conc. totale polimero] = [P] + [PX] + [PX 2 ] + [PX 3 ] + [PX 4 ]= = [Hb] + [HbX] + [HbX 2 ] + [HbX 3 ] + [HbX 4 ]

5 1)ciascun sito di legame può legare una sola molecola di legante; 2) i siti sono identici; 3) i siti sono indipendenti, quindi non interagiscono tra loro e hanno tutti la stessa energia di interazione con il legante, indipendentemente da quante molecole di legante si siano già legate sul polimero.

6 Poiché gli n siti sono tutti identici e indistinguibili e consideriamo gli eventi di binding indipendenti tra di loro, possiamo prendere in considerazione lequilibrio generico: sito libero + X sito occupato

7

8 Moltiplicando e dividendo per [P] tot a destra:

9 Da cui si ottiene:

10 nK

11 Θ = frazione di siti occupati 0 Θ 1 Θ = probabilità di trovare un sito occupato ( n siti identici e indipendenti) 1-Θ = probabilità di trovare un sito libero

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13 Lequazione di Langmuir può essere derivata da semplici considerazioni cinetiche: Per la velocità della reazione diretta: Per la velocità della reazione inversa:

14 Allequilibrio: Da cui si ottiene facilmente:

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16 Alternativamente:

17 Non cooperativo Cooperatività positiva Cooperatività negativa

18 Nel caso di due diversi siti di legame non interagenti n 1 e n 2 :

19 Isoterma di associazione (25°C, pH=7.2) di ioni Mg 2+ con t-RNA. n 1 =6 n 2 =10 K 1 = M -1 K 2 = M -1

20 K 1 +K 2

21 P + A PA P = macromolecola con un solo sito di binding A = ligando

22 [P] 0 [A] 0 Membrana semipermeabile Inizialmente: [P] [A] [PA] [A] Allequilibrio:

23 (A) dx = (A) sx Poiché i potenziali chimici di riferimento sono gli stessi: a(A) dx = a(A) sx (A) dx c(A) dx = (A) sx c(A) sx Assumendo: (A) dx (A) sx c(A) dx = c(A) sx E quindi:

24 Nel box di sinistra: c(A) tot,sx = c(A) b,sx + c(A) f,sx c(A) 0 = c(A) tot,sx + c(A) f,dx = c(A) b,sx + 2 c(A) f,dx c(A) b,sx = c(A) c(A) f,dx Quindi: [PA] = c(A) b,sx = c(A) c(A) f,dx [P] = [P] 0 - [PA] [A] = c(A) sx = c(A) dx

25 La costante di associazione può essere determinata dalle concentrazioni iniziali di polimero e di ligando e dalla determinazione sperimentale della concentrazione di ligando libero (scomparto di destra).

26 1.Perdita dei gradi di libertà traslazionali e rotazionali Per un legante di P.M.=200 (T=25°C):

27 2. Restrizioni alle rotazioni interne Per ogni grado di libertà interno perduto: 3. Effetti idrofobici Per 1Å 2 di superficie sottratta al solvente:

28 4.Interazioni tra gruppi funzionali (legame idrogeno, dipolo-dipolo, Van der Waals) 5. Interazioni elettrostatiche 6. Rilascio di molecole di solvente dalla sfera di idratazione Generalmente a T amb : Processi di associazione sono generalmente guidati dallentropia.

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