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A bc d 10°20°30°40°50°T(°C) (287nm) a) pH= 1.13 b) pH= 2.10 c) pH= 2.77 d) pH= 3.15 forma nativa forma denaturata RibonucleasiP.M.=14000.

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1 a bc d 10°20°30°40°50°T(°C) (287nm) a) pH= 1.13 b) pH= 2.10 c) pH= 2.77 d) pH= 3.15 forma nativa forma denaturata RibonucleasiP.M.=14000

2 Denaturazione termica della Chimotripsina (pH=2.0) N D

3 Denaturazione termica della Ribonucleasi A (pH=2.1)

4

5 A pH=2.5, T=303K, p=1 atm: Predomina la forma nativa A pH=2.5, T=313K, p=1 atm: Predomina la forma denaturata

6 Parametri termodinamici per la denaturazione termica della Ribonucleasi A (pH=2.5)

7 G°(D) G°(N) 20° 40° 60° 80° T(°C) TmTm TmTm ΔG°= G°(D)-G°(N)

8 Forma nativa Forma denaturata

9 La variazione di capacità termica del processo di denaturazione è data dalla differenza tra le rette caratteristiche della forma nativa e denaturata: Dallintegrazione della curva sperimentale si ottengono la variazione entalpica ed entropica del processo:

10 Le variazioni entalpiche ed entropiche con la temperatura sono grandi e positive. Il contributo entalpico è sfavorevole al processo di denaturazione e lintero processo è quindi guidato dal contributo entropico favorevole. G 0 è piccolo a causa di effetti di compensazione tra effetti entalpici ed entropici. Bastano piccole variazioni nei contributi entalpici ed entropici per far variare il segno complessivo dellenergia libera standard. Laumento di pH sfavorisce il processo di denaturazione ( G 0 > 0), il punto di flesso delle curve di transizione ( G 0 =0, H 0 = T m S 0 ) si sposta a temperature maggiori. ; La capacità termica è relativamente elevata (ΔC p °2kcal·mol -1 ), come conseguenza della elevata dipendenza dei termini entalpici ed entropici dalla temperatura.

11 Landamento è in accordo con quanto previsto dallequazione di Vant Hoff: Poiché H 0 >0 la reazione di denaturazione è favorita da un aumento di temperatura. Analogamente, poiché: laumento di temperatura favorisce lo stato a entropia maggiore (forma denaturata).

12 Le proteine tendono ad essere più stabili intorno al punto isoelettrico (carica nulla). 1.Il pH influenza gli equilibri di deprotonazione dei residui polari (Lys, Gln, Asp) e determina la carica totale sulla superficie proteica (repulsione elettrostatica tra i gruppi ionizzabili). 2.Determina inoltre la rottura dei ponti salini tra gruppi ionizzati di diverso segno (Ex. Asp70 e His31 nella lisozima). Come risultato molte proteine denaturano in maniera irreversibile a valori estremi di pH (pH 10).

13 La denaturazione di una proteina può essere anche indotta mediante laggiunta di agenti chimici in grande eccesso, come lurea o lo ione guanidinio. - formazione di legami idrogeno competitivi con i gruppi peptidici; - stabilizzazione dello stato denaturato attraverso linterazione preferenziale con la superficie proteica. Infatti lurea e lo ione guanidinio aumentano la solubilità di tutti i residui, sia polari che apolari, diminuendo di circa il 30% lentità del contributo idrofobico, con un conseguente aumento della superficie esposta.

14 Ferritina umana

15 Linsieme di questi effetti è dovuto in larga parte a fenomeni di solvatazione. Glu Arg Phe Ile Leu Val Lys Arg Lys Arg GluLys Phe Ile Leu Val Forma nativa Forma denaturata Formazione di clusters di acqua intorno ai residui apolari

16 Allaumentare della temperatura cresce il peso del contributo entropico favorevole, favorendo il processo di denaturazione. Inoltre allaumentare della temperatura le strutture ordinate di solvente tendono a rompersi, rilasciando molecole libere di muoversi liberamente in soluzione. Questo comporta un ulteriore aumento di entropia e anche una variazione entalpica associata alla parziale distruzione dei legami idrogeno che stabilizzavano le strutture a clusters. Il risultato dellinsieme di questi processi è una forte dipendenza dei contributi entalpici ed entropici dalla temperatura.

17 N MG D Il Molten Globule rappresenta una struttura intermedia tra la forma nativa e quella denaturata. E caratterizzato da un contenuto di struttura secondaria paragonabile a quello della forma nativa, ma con un volume molare molto più grande (~50%).

18 Le caratteristiche principali di uno stato molten globule sono: (i)le dimensioni totali di questo stato sono minori di quelle associate ad un gomitolo statistico e sono solo lievemente maggiori di quelle dello stato nativo; (ii) il contenuto di struttura secondaria è confrontabile con quello dello stato nativo; (iii) le interazioni con il solvente (cioè la superficie esposta al solvente) sono molto maggiori di quelle dello stato nativo, ma molto minori dello stato completamente denaturato; (iv) linterconversione molten globule stato denaturato è rapida e non cooperativa, mentre linterconversione molten globule stato nativo è lenta e cooperativa.

19 Fluttuazioni intorno allo stato nativo

20 Il numero di conformazioni possibili per un polipeptide composto da n residui è: dove ω rappresenta il numero di conformazioni popolato da ogni residuo. Lesponente (n-2) tiene conto del fatto che i due residui terminali restano comunque liberi in qualunque conformazione. Dallapprossimazione degli isomeri rotazionali: ω =9. Quindi per n=100 (miniproteina):

21 Sperimentalmente si è trovato che in media: ω =3.5. Assumendo Ω N 1 per una proteina nel suo stato nativo e calcolando la variazione entropica per mole di proteina: La variazione di entropia conformazionale è di ca cal·mol -1 ·K -1 per residuo!

22 Paradosso di Levinthal Ipotizzando che un sistema popoli ciascuna conformazione per un tempo dellordine di 1 ps ci vorrebbero ca. 6·10 33 anni per analizzare tutte le possibili conformazioni. Proteine (in vivo e in vitro) raggiungono la conformazione nativa in un tempo che varia tra 0.1 e 1000 secondi. Il processo di folding deve essere un processo guidato attraverso un cammino non casuale!

23 Φ Φ = Frazione di molecole che raggiungono rapidamente lo stato nativo 1-Φ 1-Φ = Frazione di molecole che raggiungono stati metastabili (minimi locali di energia)

24 k D k D N D k F k F Es. Lisozima k D e k F rappresentano rispettivamente le costanti cinetiche del processo di denaturazione (N D) e del processo di folding (N D). Perché valga questo tipo di modello gli stati intermedi devono essere tutti fortemente instabili.

25 Da un punto di vista cinetico: Dividendo entrambi i membri per la concentrazione totale [N] + [D]:

26 Introducendo la variazione delle frazioni molari della forma nativa e denaturata dai valori di equilibrio: f N = f N – f N(eq) f D = f D – f D(eq) Allequilibrio: k D f N(eq) = k F f D(eq)

27 A tutti i tempi (conservazione di massa): f N = - f D La cui soluzione è: In un meccanismo a due stati la cinetica di denaturazione e di folding avvengono con la stessa costante cinetica.

28 N X D Es. Ribonucleasi veloce lento Lo stato intermedio X presenta regioni strutturalmente ordinate che assumono la funzione di centri di nucleazione attorno ai quali si completa il folding proteico.

29 Il modello più semplice prevede un solo stato intermedio: k 1 k 2 N X D k -1 k -2 La soluzione dellequazione cinetica è: Le cinetiche di folding e unfolding per un processo a tre stati non sono le stesse.

30 A)Nucleazione e crescita rapida D I1 I2 I3 I4 I5 N Nucleazione (lenta) crescita (rapida) In questo modello vi è un primo evento di nucleazione verso lintermedio corretto che porterà alla strutturazione nativa. Questo primo passo è lento e il processo di sampling delle conformazioni casuale. Gli stadi successivi (crescita) sono rapidi e portano irreversibilmente alla struttura nativa.

31 U1U1 U2U2 U3U3 U4U4 U5U5 I1I1 I2I2 I3I3 I4I4 N B) Modello generale statiunfolded statiintermedi intermedio pre-foldato (MG) strutturanativa

32 I II III

33 I.Collasso veloce della catena proteica in una conformazione compatta (Molten globule) I tempi sono dellordine dei microsecondi. II. Esplorazione delle strutture compatte III. Transizione tra stati misfolded e struttura nativa (lento) La transizione tra stati misfolded e struttura nativa è un processo attivato, generalmente lento. Per una barriera di energia dellordine di 7 kcal·mol -1, il tempo stimato necessario alla transizione è dellordine di qualche secondo.

34 Cinetica bifasica di un processo di folding Collasso veloce Processi attivati


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