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ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE.

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Presentazione sul tema: "ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE."— Transcript della presentazione:

1 ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE

2 PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL INGEGNERIA GENETICA -PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita). -PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (enzimi). -PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI. -REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA. Applicazioni delle proteine ricombinanti

3 Sistemi di espressione Procariotici (E.Coli) Eucariotici: Saccharomyces Cerevisiae (lievito) Cellule di insetto (Baculovirus) Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.) Animali transgenici Piante transgeniche

4 Per evitare degradazione di proteine eterologhe e per permetterne una più semplice purificazione, queste vengono prodotte come proteine di fusione con una proteina stabile dellorganismo ospite. PROTEINE DI FUSIONE Un TAG è una sequenza proteica con proprietà che ci permettono di purificare la proteina dinteresse TAG DIMENSIONELIGANDO GST25 kDaglutatione MBP40 kDaamilosio FLAG (DYKDDDDK)8 aa Anticorpo monoclonale specifico His-tag6-10 aaNi 2+

5 GST β-Lattamasi

6 Dominio catalitico PTP1B GST PTP PROTEINE DI FUSIONE

7 NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA PROVOCA: -inibizione funzioni cellula -perdita energia -perdita plasmide Forti – Alta affinità per lRNA polimerasi – Legame forte – trascritto ad alta frequenza – Legame debole- RNA Pol si stacca, no trasc. Regolabile – Lespressione può essere controllata dal ricercatore, tramite induttori e repressori

8

9 Lattosio IPTG

10 1.TRASFORMAZIONE DEL VETTORE DESPRESSIONE (CODIFICANTE PER LA PROTEINA DI FUSIONE) IN OSPITE. 2.AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO. 3.INDUZIONE DELLESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE. 4.PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE

11 Amp Gene di interesse 1. TRASFORMAZIONE E. Coli Assunzione di DNA da parte di un organismo

12 1. TRASFORMAZIONE

13 12-16 ore 37°C 2-5x10 9 cellule (N = N 0 2 n ) LB: Lysogeny Broth (Luria Broth) Tryptone (fonte aminoacidica) Estratto di lievito (vitamine e elementi in tracce) NaCl 2. AMPLIFICAZIONE

14 FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano) FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono t Unità formanti colonie latenza esponenziale plateau morte

15 IPTG 2 ore 37°C 3. INDUZIONE DILUIZIONE 1: ore assorbanza

16 LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA rpm supernatante Pellet (batteri) 1. Recupero batteri 2. Lisi congelamento/scongelamento Lisozima (1 mg/ml) (agisce sulla membrana esterna) Sonicazione (ultrasuoni) 3. Recupero componente proteica detergenti rpm Supernatante (proteine) Pellet (membrane, DNA) 4. PURIFICAZIONE

17 AZIONE DEL LISOZIMA PARETE Gram - LISOZIMA Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in tessuti animali dotato di attività battericida. Lisa la parete batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra lacido N-acetilmuramico (NAM) e la N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente principale delpeptidoglicano.

18 ESTRATTO PROTEICO + LAVAGGI con PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 GLUTATIONE IMMOBILIZZATO SU BIGLIE DI SEFAROSIO 3000 RPM RIMUOVO IL SUPERNATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE Immobilizzazione della proteina di fusione su supporto solido

19 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) POZZETTI PER CARICAMENTO STACKING GEL SEPARATING GEL 5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8 ACRILAMIDE 5% SDS TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8 ACRILAMIDE > 5% SDS - +

20 running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore. stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza.

21 Loading buffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8 2% SDS 10% Glycerol 1% b-Mercaptoethanol 12.5 mM EDTA 0.02 % Bromophenol Blue + loading buffer 95° C COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA LELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO LSDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALI PONTI DISOLFURO + CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL SUPERNATANTE CONTENENTE LA PROTEINA rpm

22 PROTEINA NATIVA RUOLO DELLSDS NELLA CORSA PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA RAPPORTO CARICA/MASSA SIMILE PER TUTTE LE PROTEINE NEL CAMPIONE LSDS LEGA LE PROTEINE IN UN RAPPORTO DI UN ANIONE OGNI 2 aa LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA La separazione avviene quindi per differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa carica per ogni proteina denaturata con SDS rimane costante. Il trattamento con SDS elimina le differenze di forma, quindi la lunghezza della catena polipeptidica, che riflette la massa, e lunico determinante della velocita di migrazione.

23 IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA 25 mM Tris HCl pH mM Glicina 0.1% SDS

24 Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica negativamente e comincia a migrare con una certa velocità pH 8.3 Arrivata al loading buffer e allo stacking (entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Cl - sono la specie più veloce pH 6.8 pH 8.8 Cl - Gly Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse in una regione ad elevata mobilità elettroforetica

25 EFFETTO STACKING Allinizio del separating gel il pH 8.8 riporta la glicina ad un rapporto carica/massa maggiore rispetto a quello delle proteine. La glicina supera i polipeptidi, che non trovandosi più in una regione ad elevata mobilità elettroforetica rallentano notevolmente e si ritrovano compattati in una linea molto sottile. Ora le proteine si trovano tutte allo stesso livello. Nel separating la concentrazione di acrilamide è più alta, e comincia la separazione del campione in base al peso molecolare. Cl - Gly PROTEINE COLORANTE

26 Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il colorante lega arginina, istidina e aminoacidi aromatici, rendendo visibili le proteine su gel in base alla loro quantità.

27 APPLICAZIONI 1.SI PUO SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER ESPERIMENTI DI PULL DOWN 2.SI PUO ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI SEFAROSIO E UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI 3. SI PUO SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO


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