La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di."— Transcript della presentazione:

1 ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dellapparato respiratorio 1956 studi epidemiologici confermano lorigine virale dellagente eziologico delle malattie acute dellapparato respiratorio. Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili

2 più di 100 membri ADENOVIRIDAE

3 SottogruppiTropismo cellulareSierotipi A tratto GI 12, 18, 31 B polmoni, tratto urinario 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 C alte e basse vie dellapparato respiratorio 1, 2, 5, 6 D tratto GI, occhi 8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30, 32, 33, 36,39, 42,49, 51 E tratto respiratorio 4 F-G tratto GI 40, 41 Adenovirus umani virus generalmente poco patogeni infezioni lievi ed autolimitanti

4 STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS Capside (252 capsomeri) proteina VI ancora lanello di esoni che circondano ipentoni con il core proteina VIII ancora gli esoni delle facce al core proteina IIIA esoni che circondano i pentoni proteina IX esoni delle facce Core : ds DNA - covalentemente legato alla proteina TP - complessato alla proteina VII proteina X (proteasi) proteina V core proteasi nm 240 esoni : trimeri di proteina II 12 pentoni : Base (pentameri di proteina III) Fibra (trimeri di proteina IV) nm

5 Il GENOMA degli ADENOVIRUS sequenza di impacchettamento (ds DNA: Kb) ITR regioni di controllo trascrizionale siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I regione ORI (replicazione del genoma) SEQUENZE ITR (100bp)

6 Penetrazione di Adenovirus entrata mediata da endocitosi clatrina- dipendente Perdita delle fibre Lisi della membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale : - perdita dei pentoni III e della proteina IIIa - dissociazione della proteina VIII - degradazione proteolitica della proteina VI da parte della proteasi presente nel virione ( adenina ) - perdita della proteina IX pH

7 PENETRAZIONE DEL GENOMA liberazione del DNA virale complessato alla proteina VII

8 ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS E- geni precoci L- geni tardivi geni precoci geni tardivi 50 proteine

9 I GENI PRECOCI ITR E1A/BE2A/B ITR E3 E4

10 GENE E1A progressione del ciclo cellulare - legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein) trans-attivatori trascrizionali di geni virali e cellulari mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R induzione di apoptosi - stabilizzazione di p53

11 Ruolo di pRb nella regolazione della proliferazione cellulare E1A

12 p14 E1A

13 GENE E1A Alterano la progressione del ciclo cellulare: trans-attivatori trascrizionali Stimolano la replicazione del DNA virale Bloccano la risposta ci difesa cellulare: - inibizione di STAT1 - inibizione di IKK mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R

14 Proteine E1B 55 kDa - lega, inibisce e induce la degradazione di p53 19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di Bax Stabilizzazione, esporto e traduzione preferenziale dei trascritti virali. Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite.

15 CAR E1A pRB geni proliferativi E1B 55kd p53 geni pro-apoptotici I B NF- B risposta innata E1A E1B 19kd integrine MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE

16 ESPRESSIONE GENICA ITR E1A/B L5 E2A/B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 E2A - ssDBP) E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale replicazione del DNA trascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali

17 ESPRESSIONE GENICA ITR E1A/B L5 E2A/B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 proteine che regolano la risposta della cellula ospite allinfezione

18 ESPRESSIONE GENICA ITR E1A/B L5 E2A/B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off della sintesi proteica cellulare

19 Virus-Associated (VA) RNA VAI 1 o 2 trascritti lunghezza: 200 basi codificati dalla Polimerasi III della cellula ospite VA - mantenimento della sintesi proteica - inibizione delle difese anti- virali inibizione della dimerizzazione di PKR

20 CICLO DI REPLICAZIONE

21 REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori La sequenza Ori: sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali (aumento dellefficienza di replicazione) proteina TP legata al terminale 5 di ogni filamento

22 REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori - la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza ausiliaria facilita la formazione del complesso reclutamento della Polimerasi virale e della proteina pre-TP sulla sequenza core - il 3OH di dCMP serve da innesco per la sintesi del DNA complementare

23 From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press lelica di DNA dislocata forma un panhandle via gli inverted terminal repeats associazione Pol-pre-TP e …… sintesi del filamento complementare

24 I geni intermedi o precoci-ritardati gene IX = proteina IX stabilizzazione del capside virale gene IVa2 = proteina IVa2 transattivazione del promotore dei geni L in associazione con L1 52/55 ed E1A incapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati esone trimeri di pIX

25 ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI ITR E1A/B L5 E2A/B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 promotore MLP L1 L2 L3 L4 L5 E1A MLTF IVa 52 kd unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5 identiche, divisi nei 5 gruppi L proteine strutturali proteine scaffold proteasi

26 E4 orf6 (34KDa) E1B 55KDa accumulo citoplasmatico di mRNA virali RNA binding NES blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma ? TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L trasporto facilitato fattore cellulare

27 TRADUZIONE PREFERENZIALE nelle fasi tardive dellinfezione blocco della sintesi proteica della cellula ospite eIF4F m7G Ad virus ( shutoff proteins : L ed E proteins)

28 tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di 200 nucleotidi al 5 (tripartite leader) che permette il ribosome shunting L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIa L2 - polipeptide III (base dei pentoni) L3 - polipeptide II (esoni) e proteasi L4 - polipeptide 100 kDa L5- polipeptide IV (fibre) TRADUZIONE PREFERENZIALE

29 Assemblaggio di adenovirus proteine singole (no poliproteina) ruolo critico della proteina L1 (funzione scaffold ?) citoplasma - formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4. - formazione dei pentameri di proteina III (pentoni) - formazione dei trimeri di proteina IV (fibre) formazione di capsidi vuoti nucleo

30

31 disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi) E3 - death protein (meccanismo sconosciuto) RILASCIO DEL VIRUS

32 Adenovirus terapeutici

33 TERAPIA GENICA introduzione del gene esogeno nella cellula malata - correzione del difetto genetico - trasformazione di pro-drug - blocco del processo tumorale espressione della proteina

34 Il DNA si degrada velocemente Sistemi di veicolazione del DNA Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione Meccanismi non virali liposomi polimeri cationici elettropazione micro-iniezione ottima protezione del DNA buona efficienza e specificità possibile rischio di infezione reazioni immunitarie buona protezione del DNA bassa efficienza, nessuna specificità assenza di rischio e di reazioni immunitarie Meccanismi virali

35 infezioni lievi sicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità) infezione di cellule in divisione e resting facile manipolazione ADENOVIRUS VETTORI PER TERAPIA GENICA 1)sicurezza 2)alta infettività e selettività 3)espressione sostenuta del gene terapeutico

36 VETTORI ADENOVIRALI inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa (quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb) ITR E1A/B L5 E2B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 genoma virale ITR E1A/B transgene vettore navetta ITR L5 E2B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 vettore adenovirale transgene ricombinazione

37 293 cell La produzione dei vettori adenovirali avviene in cellule della linea cellulare HEK293) E1A E1B ITR L5 E2B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 transgene nucleo lisi

38 VETTORI ADENOVIRALI Trials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF) - bassa efficienza di transfezione (le cellule transfettate - distrutte dallinfezione virale) -bassa efficienza di espressione genica - potente risposta immunitaria -un esito mortale (danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria scatenata dalle elevate quantità di vettore virale somministrato) Attualmente non sono utilizzati in trials di terapia genica nelluomo

39 però……… la sperimentazione continua VETTORI ADENOVIRALI

40 VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA genoma virale plasmidico ITR transgene vettore navetta ITR E2A/B ITR L1 L2 L3 L4 VA E4 transgene E2A/B ITR L1 L2 L3 L4 VA E4 promoter ricombinazione in cellule 293 promoter ITR E2B ITR transgene promoter taglio mediato da Cre loxP L5

41 La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacità avviene in presenza di un costrutto helper ITR E2B ITR transgene promoter ITR E2A/B ITR L1 L2 L3 L4 VA E4 L5 lisi cellulare

42 Vantaggi: infezioni lievi sicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità) infezione di cellule in divisione e resting facile manipolazione alta capacità (35 kbp) espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80 giorni) VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA Limitazioni: contaminazione da helper (in produzioni su larga scala) bassa resa scarsa stabilità

43 TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA Distrofia muscolare (sindrome di Douchen) Fibrosi cistica

44 ADENOVIRUS ONCOLITICI ADENOVIRUS Onyx (dl1520) ITR E1A/B L5 E2A/B ITR E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 genoma Ad * * non esprime E1B 55K – delezione di 827-bp nel gene E1B e parte della regione E3 (gp19K)

45 ADENOVIRUS dl1520 replica solo in cellule difettive per p53 p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani e nel 70% dei tumori della testa e del collo trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa tumorale)


Scaricare ppt "ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di."

Presentazioni simili


Annunci Google