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Le funzioni dei geni STM e WUS sono interconnesse a vie di signaling ormonali CITOCHININE GIBBERELLINE.

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Presentazione sul tema: "Le funzioni dei geni STM e WUS sono interconnesse a vie di signaling ormonali CITOCHININE GIBBERELLINE."— Transcript della presentazione:

1 Le funzioni dei geni STM e WUS sono interconnesse a vie di signaling ormonali CITOCHININE GIBBERELLINE

2 Diversi studi indicano che esiste una correlazione positiva tra lespressione/funzione dei geni KNOX e le CITOCHININE (CK) CK promuovono la divisione cellulare e la morfogenesi Piante overesprimenti KNOX hanno elevati livelli di CK Piante con elevati livelli di CK overesprimono geni KNOX e una correlazione negativa con le GIBBERELLINE (GA) Le GA promuovono lespansione cellulare e la crescita degli organi, incompatibile con il mantenimento dellomeostasi meristematica STM reprime la sintesi di gibberelline nel SAM

3 GA CK inibiscono la crescita del meristema mutanti spindly con ridotti livelli di CK (35S::AtCKX3) hanno bassa attività meristematica Wt spy-1 35S::AtCKX3 spy-1,35S::AtCKX3 spy-1 Spy-1,35S::AtCKX3 crescita determinata del meristema della infiorescenza wt spy-1 spy-1;AtCKX3 spindly: attivazione costitutiva GA signaling spy-1,35S::AtCKX3

4 Piante transgeniche di arabidopsis overesprimenti GR::STM (promotore inducibile) RTPCR 10gg 1 M DEX STM nellapice induce la sintesi di geni della biosintesi delle CK (IPT7) e la sintesi di geni di della via di signaling (ARR5) GR= promotore del recettore dei glucocorticoidi DEX= dexametasone

5 Piante transgeniche di arabidopsis overesprimenti STM (GR::STM) RTPCR STM nellapice induce lespressione di geni (GA 2 ossidasi) che inattivano le GA (da studi di espressione di GA 2 ossidasi in mutanti wol: effetto non diretto ma mediato da CK )

6 In tabacco dimostrato che geni KNOX (STM) agiscono come repressori trascrizionali del gene della GA20 ossidasi La GA20 ossidasi è un enzima necessario alla di GA attive

7 Biosintesi delle Gibberelline (dalla GA 12 - aldeide) GA20 ox

8 Via di Biosintesi delle GA

9 STM nel SAM attiva la biosintesi delle CK e reprime sintesi della GA 20 ox e quindi la biosintesi delle GA e promuove lattività meristematica. CK attivano lespressione di GA 2 ox stimolando linattivazione delle GA. Il risultato è che le GA attive vengono confinate nelle foglie cotiledonari

10 GA2ox controls GA movement into the shoot meristem Sakamoto, T., Kobayashi, M., Itoh, H., Tagiri, A., Kayano, T., Tanaka, H., Iwahori, S., and Matsuoka, M. (2001). Expression of a gibberellin 2-oxidase gene around the shoot apex is related to phase transition in rice. Plant Physiol. 125: Before the transition to flowering, OsGA2ox1 is expressed just below the shoot meristem, selectively excluding GA 1 and GA 4. GA 4 GA 5 It has been shown in Lolium that GA 5 (which is resistant to deactivation by GA2ox) can move into the meristem despite GA2ox activity. OsGA2ox1 mRNA

11 FUNZIONE DEL GENE WUSCHEL

12 Piante di arabidopsis overesprimenti WUS con promotore inducibile da etanolo Espressione ectopica di AG::GUS In risposta allinduzione di WUS (AGAMOUS= bersaglio di wuschel) Microarray RT-PCR STM WUS t ARR5 ARR6 ARR7 ARR15 RT PCR Alc::CLV3Alc::GUS

13 WUSCHEL Reprime la trascrizione dei geni ARR5, ARR6, ARR7 e ARR15 che codificano per regolatori di risposta nel sistema a due componenti attivato dalle citokinine ARR5, ARR6, ARR7, e ARR15 agiscono come regolatori negativi della risposta alle citokinine

14 MECCANISMO DI AZIONE DELLE CK

15 NETWORK REGOLATIVI PER IL MANTENIMENTO DEL SAM SAM

16 STIMPY (STIP/WOX9): necessario per laumento delle dimensioni del meristema nel mutante clv3-2 ULTRAPETALA HD-ZIP HANABA TARANU AP2 Regolatori negativi di WUS SPLAYED (SYD) : regolatore diretto di WUS (fattore di rimodellamento della cromatina) NETWORK REGOLATIVO DI WUS

17 INTERAZIONE TRA FATTORI DI TRASCRIZIONE E ORMONI NELLAPICE MERISTEMATICO

18 FORMAZIONE DEL MERISTEMA APICALE DELLA RADICE

19 L'ipofisi, nello stadio globulare tardivo si divide in due cellule, dando una cellula superiore a forma di lente, e una cellula inferiore che va incontro subito ad una divisione longitudinale. La cellula lenticolare si dividerà ulteriormente e formerà la porzione interna del RAM, ovvero le 4 cellule del centro quiescente. Le due cellule inferiori si divideranno sia longitudinalmente sia trasversalmente, formando le iniziali della porzione apicale della cuffia radicale (o columella).

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21 Apice radicale di arabidopsis

22 Il segnale di formazione del meristema apicale radicale è generato da alti livelli di IAA nella regione basale del proembrione Elevati livelli di IAA sono causati dal trasporto polare di IAA mediato dalle proteine PIN

23 Espressi con diversa localizzazione in tempi diversi dello sviluppo dellembrione; La sequenza di espressione, regolata temporalmente e spazialmente, è responsabile della variazione della direzione del flusso di IAA durante lembriogenesi. Espressione geni PIN

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25 Trasporto di IAA nella radice Massima concentrazione di IAA nelle iniziali della columella

26 Proteine PIN PIN7 nelle membrane laterali e basali delle cellule provascolari, nella zona di distensione e nelle cellule della columella. PIN1 parte basale delle cellule del cilindro vascolare; PIN2 estremità basale delle cellule corticali e allestremità apicale delle cellule epidermiche e della cuffia laterale; PIN3 espressa, senza polarità apparente, in due file sovrapposte di cellule della columella e nel periciclo; PIN4 localizzazione non polarizzata nelle cellule del centro quiescente e nelle cellule che lo circondano, nonché allestremità basale nelle cellule provascolari;

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29 Nei meristemi del germoglio (SAM) e della radice (RAM) la popolazione di cellule staminali è mantenuta grazie allattività di un centro organizzatore SAM: centro organizzatore specificato dal gene WUSCHEL RAM: centro quiescente (QC); lidentità di QC è specificata dai geni SHORT ROOT e SCARECROW è richiesta anche lespressione dei geni PLETHORA1 e PLETHORA2 Codificano per fattori di trascrizione di tipo AP2 Sono espressi inizialmente nella regione basale dellembrione, poi nel primordio della radice e infine nel centro quiescente CENTRO QUIESCENTE (QC)

30 CENTRO QUIESCENTE Localizzazione determinata da massimo di concentrazione di auxina Espressione dei geni SHORT ROOT e SCARECROW Espressione dei geni PLETHORA1 e PLETHORA2

31 SHORT-ROOT (SHR) e SCARECROW (SCR) Necessarie per la formazione ed il mantenimento delle cellule staminali del CQ. Le proteine SHR sono prodotte nella stele e traslocano nelle cellule adiacenti Attivazione espressione SRC

32 Geni PLETHORA (PLT ) Codificano per fattori di trascrizione di tipo AP2; Richiesti per specificare lidentità delle cellule del QC e per il corretto pattern di divisione delle cellule circostanti; La loro espressione è controllata da MONOPTEROS; Lespressione dei geni PLT è modulata e modula lespressione dei geni PIN.

33 Mutanti plt1 e plt2 hanno alterazioni nel pattern di divisioni cellulari nel QC e nella columella Columella WT: 4 file di cellule la prima di staminali le altre differenziate (accumulo granuli di amido) Columella plt1: ulteriori file di cellule dovute ad aumento di divisioni nello strato 1 WT plt1-4plt2-2 plt1-4 plt2-2 QC PLETHORA

34 La columella contiene più cellule, la struttura a strati è alterata; si accumulano granuli di amido anche negli strati che dovrebbero essere occupati da cellule staminali La crescita della radice è ridotta Il numero delle cellule meristematiche è molto ridotto Lespressione del gene reporter cyclin-GUS (marcatore fase G2/M) è limitata Sviluppo postembrionale Zona meristematica Mutazioni dei geni PLT riducono il numero di cellule meristematiche e la lunghezza della radice plt1-4 plt2-2

35 I geni PLT sono espressi nella regione basale dellembrione nello stadio globulare a 8 cellule sono richiesti per specificare lidentità delle cellule del QC Ibridazione in situ PLT1 cellula progenitrice del QC

36 WTplt1-4 plt2-2WT plt1-4 plt2-2 Espressione di marcatori del centro quiescente nello stadio a cuore (QC25) (QC46) La funzione PLT è richiesta nello stadio iniziale della determinazione dellidentità del QC e per il corretto pattern di divisione delle cellule circostanti

37 PLT1 e PLT2 agiscono in parallelo con i geni SHORT ROOT/SCARECROW nel pattern di specificazione del centro quiescente SCR e SHR necessari per lespressione dei marcatori del CQ (QC 25; QC46) I domini di espressione di PLT1 PLT2 e SHR/SCR si stabiliscono in maniera Indipendente wt plt1-4 plt2-2 Espressione di SHR::GFP wt plt1-4 plt2-2 Espressione di SCR::YFP

38 Ibridazione in situ PLT1 wtscr-1 shr-1 3dpg

39 Lespressione dei geni PLT risponde a cambiamenti di distribuzione dellauxina e dipende dai fattori di risposta allauxina (ARF) Ibridazione in situ assenza di segnale per PLT1 Necessario doppio mutante per ridondanza proteine ARF doppio mutante mp-G12 nph4-1 Embrione nello stato di transizione

40 Lespressione di PLT è controllata dal gradiente di IAA determinato dalla localizzazione di PIN e da MP; Le proteine SHR sono prodotte nella stele e traslocano nelle cellule adiacenti, dove attivano SRC; Il centro quiescente è specificato nella zona dintersezione dei domini despressione dei geni PLT, SHR e SCR; I pattern despressione di SHR, SCR e PLT definiscono le differenti regioni; In presenza dei geni PLT SHR e SCR sono coinvolti nella specificazione delle cellule staminali; in assenza di PLT SHR regola il differenziamento delle cellule derivate dalle staminali.

41 MODELLO Le cellule che esprimono PLT SCR e SHR diventano QC QC segnala alle cellule circostanti per mantenere lidentità meristematica

42 alterazione dei flussi auxinici rimodulazione della espressione dei geni PLT (SHR, SCR, PIN) rispecificazione del centro quiescente Esperimenti di ablazione con laser del centro quiescente DR5::GFP SCR SHR qc ablati

43 PIN1 PIN2 qc ablati

44 Ablazione: shift gradiente auxinico; espressione PLT; inibizione espressione PIN; Loc nucleare di SHR; promozione espressione SCR

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46 qc

47 Network regolativo nel meristema della radice WOX5 è un omologo di WUSCHEL: contribuisce a mantenere le cellule del CQ in srtato indifferenziato

48 CK nel meristema radicale controllano la velocità di differenziamento delle cellule meristematiche della radice e quindi le dimensioni del meristema

49 CK esogene riducono il numero di cellule meristematiche senza influenzare Le dimensioni del QC e della Columella quindi senza influire sul loro potenziale meristematico Dimensioni del Meristema: N° di 1 fila di cellule del cortex dal QC alla TZ

50 Mutanti biosintetici per le CK o mutanti nella via di signaling hanno meristemi più grandi ahk3

51 AHK4/CREI1/WOL AHK3 AHK2 Recettori per le CK (sistema a due componenti Istidina kinasi) AHK3 è lunico espresso in tutti i tessuti della zona di transizione AHK3 ARR1ARR12 ARR1 e ARR12 sono espressi solo nella TZ

52 MODELLO UN SISTEMA A DUE COMPONENTI DI SIGNALING PER LE CK BASATO SU AHK3/ARR1, AHK3/ARR12 MEDIA IL CONTROLLO DEL NUMERO DELLE CELLULE MERITEMATICHE NELLA ZONA DI TRANSIZIONE LE CK AGISCONO ANTAGONIZZANDO UN SEGNALE DI DIVISIONE CELLULARE (AUXINA) Applicazioni di auxina esogena alla radice incrementano le dimensioni del meristema La riduzione di livelli di CK in tripli mutanti pin non ha effetto sullle dimensioni del meristema

53 CK attivano SHY2 che media la repressione dellespressione delle proteine PIN IAA media la degradazione tramite proteosoma di SHY2 IAA è il segnale per la divisione cellulare meristematica nella radice

54 SHY2 è una proteina AUXIAA Controlla la biosintesi delle CK Attraverso la IPT5 Gli effetti antagonistici tra IAA e CK Sono spiegati in base al conrollo negativo da parte di CK sulla distribuzione PIN-dipendente di IAA

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56 RBR: PROTEINA DEL RETINOBLASTOMA (antagonizza nei mammiferi la funzione meristematica) Mutanti di arabidopsis rbr loss of function mostrano divisioni cellulari in più e ritardo del differenziamento della radice Loverespressione di RBR causa differenziamento precoce RBR proteina regolativa per il differenziamento nella radice Non sono alterati i pattern di espressione di PLT, SCR, SHR RBR agisce a valle di SCR/SHR; PLT mutanti scr hanno livelli più alti di RBR

57 Le CK promuovono il mantenimento del meristema del germoglio ma hanno la funzione opposta nel meristema radicale dove stimolano il differenziamento nella zona di transizione Lauxina è necessaria per la formazione del meristema radicale ma nel meristema del germoglio promuove lorganogenesi Sia nel germoglio che nella radice il mantenimento del meristema dipende dal bilancio tra CK e auxina ma le risposte sono diverse nei due meristemi Quali funzioni cellulari sono controllate dai due ormoni nei meristemi del germoglio e della radice? SAM/RAM

58 DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE EPIDERMICHE NELLA RADICE Le cellule epidermiche confinanti con lo spazio tra due corticali diventano TRICOBLASTI

59 SE UN TRICOBLASTO VIENE RIMOSSO (ablazione laser) L A TRICOBLASTO VICINO PRENDE IL SUO POSTO ( e viceversa) IL DIFFERENZIAMENTO E DIRETTO DALLA INFORMAZIONE POSIZIONALE

60 Mediante lanalisi di mutanti identificati geni regolatori per il differenziamento DEI TRICOBLASTI WEREWOLF (WER) (myb) regolatore negativo dellidentità tricoblastica CAPRICE (CPC) (myb) CPC regolatore negativo dellidentità atricoblastica

61 TTG1: TRANSPARENT TESTA GLABA1 GL3 : GLABRA3 (2) (1) EGL3: ENHANCER OF GLABRA3 SCM: SCRAMBLED CAPRICE: CPC

62 Modello regolativo per il differenziamento dei tricoblasti nella radice LRR-RLK CPC è espresso nelle cellule N nonostante il suo effetto inibitorio sul differenziamento azione non-cell-autonomous del gene CPC

63 WER Gl2 CPC (+) Gl2 (-) ATRICOBLASTO TRICOBLASTO


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