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Relatore Prof. Luciana Avigliano Candidata Laura Masciullo EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE TUMORALI DEL COLON UNIVERSITA DEGLI STUDI.

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1 Relatore Prof. Luciana Avigliano Candidata Laura Masciullo EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE TUMORALI DEL COLON UNIVERSITA DEGLI STUDI DI ROMA TOR VERGATA

2 CANCRO DEL COLON FATTORI GENETICI DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIO Elevato consumo ortaggi, frutta, spezie, legumi, cereali DIETA OCCIDENTALE: ALTO RISCHIO basso consumo di prodotti di origine vegetale FATTORI AMBIENTALI

3 Lorigano è ampiamente utilizzato in tutti i paesi del bacino mediterraneo

4 Effetti chemiopreventivi dellOriganum vulgare: SCOPO DELLO STUDIO proliferazione cellulare stato redox apoptosi MODELLO SPERIMENTALE: CELLULE UMANE Cancerose: cellule di adenocarcinoma del colon (Caco2) Normali: colture primarie di fibroblasti e colonociti (FHC)

5 FOGLIE E FIORI ESSICCATI FRANTUMATI FINEMENTE ESTRAZIONE CON ETANOLO 70% PER 24 ORE A 4°C, AL BUIO FILTRAZIONE SU CARTA WHATMAN NO. 1 CENTRIFUGAZIONE A 2500 RPM PER 20 MIN CONCENTRAZIONE DEL SUPERNATANTE SOTTO FLUSSO DAZOTO ESTRATTO DI ORIGANO LIOFILIZZATO PREPARAZIONE DELLESTRATTO DI ORIGANO Resa: 20 % (2.5 gr di origano essiccato = 0.5 gr estratto secco)

6 Capacità Antiossidante Totale: 2.4 ± 0.2 mmol di Trolox equivalenti/g di estratto secco Caratterizzazione dellestratto origano Contenuto Totale Fenolico (Metodo Colorimetrico Folin-Ciocalteu): 150 mg di acido gallico equivalenti/gr di estratto secco Composti fenolici flavonoidi acidi fenolicilignanimonoterpeni flavoni flavonoli flavanoni antocianine flavanoli isoflavoni stilbeni

7 ANALISI COMPOSTI FENOLICI (HPLC con rivelatore a fotodiodi = 310 nm) minuti Acido caffeico Acido rosmarinico Acido ferulico Daidzeina Esperetina

8 Composti fenolici identificati mediante analisi cromatografica (HPLC-DAD) FENOLICLASSETEMPO DI RITENZIONE (min) CONCENTRAZIONE (mg/g di estratto secco) % FENOLI Ac. rosmarinicoAcidi fenolici ± NaringeninaFlavononi ± EsperetinaFlavononi ± Ac. cumaricoAcidi fenolici ± CarvacroloTerpeni ± Ac. gallicoAcidi fenolici ± Acido caffeicoAcidi fenolici ± Ac.clorogenicoAcidi fenolici ± (+) CatechinaFlavanoli ± DiosmetinaFlavoni ± Ac.protocatecuicoAcidi fenolici ± Ac. ferulicoAcidi fenolici ± DaidzeinaIsoflavoni ± Altri fenoli ± FENOLI TOTALI173±

9 % del controllo # # # # * * # # * 300 g/ml 500 g/ml ore 120 Lorigano esercita differenti effetti sulle cellule normali e cancerose FIBROBLASTI FHC CaCo2 * p<0,05 # p<0,001

10 Eventi FL2-H Eventi FL2-H origano Ipodiploide 24% G0/G1 31% G2/M 30% S 39% Ctrl Ipodiploide10% G0/G149% G2/M14% S37% Lorigano promuove larresto della crescita nella fase G2 prevenendo lentrata in mitosi e inducendo morte cellulare Analisi al citofluorimetro

11 Lorigano induce sia la necrosi sia lapoptosi Colorazione con ioduro di propidio ed analisi al FACS Normale Apoptosi Necrosi Normale Apoptosi Necrosi origano Ctrl 13 % 12 % 18 % 30 %

12 Lorigano attiva le caspasi esecutrici Ctrl origano PARP (89 kDa) caspasi 3 (17 kDa) PARP Volte su controllo Casp-3 Ctrl origano * * * p<0,001

13 Via recettoriale Via mitocondriale pro-apoptotico anti-apoptotico tubulina caspasi 8 (18 kDa) APAF-1 (130 kDa) Bak (25 kDa) pro-caspasi 9 (47 kDa) Bcl-xL (30 kDa) Lorigano attiva la via intrinseca e la via estrinseca dellapoptosi Bcl-xLBak # # # * Volte su controllo Casp-8APAF-1Pro casp-9 Ctrl origano * * p<0,05 # p<0,001

14 Lorigano promuove una perturbazione nel potenziale di membrana mitocondriale Colorazione con JC-1 ed analisi al FACS origano Ctrl Ctrl origano Fluorescenza (unità arbitrarie)

15 Lorigano riduce il glutatione totale ed incrementa il GSSG Glutatione totale Glutatione ossidato Livelli di ROS Capacità antiossidante totale Ctrl origano Glutatione totale (nmoli/mg proteina) nmoli Trolox eq./mg proteina GSSG/GSH x 100 Origano 36% Ctrl 32%

16 Lestratto di origano promuove: Arresto della crescita e morte cellulare Alterazione dello stato redox Attivazione delle vie apoptotiche

17 Tali effetti non sono ascrivibili ad un singolo componente, ma allalimento in toto I colonociti sono le cellule che in vivo entrano a diretto contatto con la spezia La diffusione dellorigano potrebbe essere correlata a questi effetti benefici Gli effetti anti-tumorali si ottengono con quantità di origano raggiungibili con la dieta Mediterranea CONCLUSIONI 100 mg

18 Gli effetti protettivi dipendono dallestratto in toto e non dai singoli componenti volte su controllo 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 CTRL A. ROSMARINICO A. CAFFEICO A. CLOROGENICO A. COUMARICO A.GALLICO CARVACROLO (+) CATECHINA A. PROTOCATECUICO DAIDZEINA A. FERULICO ESPERETINA NARINGENINA DIOSMETINA volte su controllo 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 CTRLORI 500MIX 13 * * * p<0,001


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