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1 VIRUS A DNA Replicazione nucleare e citoplasmatica HEPADNAVIRUS Replicazione nucleare Replicazione citoplasmatica POXVIRUS.a DNAds = Adenovirus e Herpesvirus.

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1 1 VIRUS A DNA Replicazione nucleare e citoplasmatica HEPADNAVIRUS Replicazione nucleare Replicazione citoplasmatica POXVIRUS.a DNAds = Adenovirus e Herpesvirus. Poxvirus.b DNAss = Parvovirus 1) DNA lineare 2) DNAds circolare = Hepadnavirus, Poliomavirus e Papillomavirus

2 2 Parvovirus - Papillomavirus e Poliomavirus: DNA pol cellulare Adenovirus - Herpesvirus: DNA pol virale > velocità > errori Target per agenti antivirali (es. acyclovir, AZT) REPLICAZIONE del DNA VIRALE SEMICONSERVATIVA

3 3 REPLICAZIONE DEI VIRUS a DNA PROBLEMI Richiesta di un primer di inizio della replicazione del DNA lo stesso problema della cellula ospite: le DNA polimerasi non sono in grado di replicare il DNA a partire da uno stampo a ssDNA. Possono solo iniziare la replicazione a partire da regioni ds (5 3) come replicare le estremità senza perdere informazione? soluzione: specifiche caratteristiche strutturali dei genomi

4 4 Le sequenze Ori From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press siti di legame per proteine (Ori recognition proteins): Palindromi sequenze ricche di AT: facilitano lo srotolamentote sequenze dentro o vicino a regioni di controllo trascrizionale siti di legame per fattori trascrizionali e proteine con funzione di enhancer, virali e/o cellulari (aumento dellefficienza di replicazione)

5 5 Replicazione del genoma dei virus a DNA : le proteine di riconoscimento della regione ORI From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press Tutti i virus a DNA devono codificare almeno una proteina per iniziare la replicazione del genoma legame di specifiche proteine alla regione ORI del genoma virale. il legame con le proteine tende a distorcere la regione ORI eventuale reclutamento di proteine cellulari per la replicazione del DNA virale Molte delle proteine reclutate sulla regione ORI hanno attività di elicasi ATP-dipendente per lo srotolamento del DNA virale Caratteristiche comuni: I virus più grandi codificano anche la loro DNA polimerasi e altre proteine essenziali per la replicazione del genoma

6 6 TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA Presenza di proteine regolatrici virali e/o cellulari che interagiscono con sequenze promoteral 5 dei geni virali 5 sequenze cap 3 poli A ( residui di adenina) Trascrizione di geni su filamenti diversi di DNA ed in direzione opposta (es. SV40 = early e late su filamenti opposti) mRNA con introni Splicing mRNA policistronici lettura in ORF differenti Utilizzano RNA pol II cellulare

7 7 TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA nel nucleo della cellula ospite Replicazione del DNA ecc: Poxvirus: Utilizzano enzimi presenti nel core del virione Trascritti senza introni. Assenza di splicing - Organizzazione temporale (in 2 tempi) con: mRNA precoci Proteine non-strutturali mRNA tardivi Proteine strutturali

8 8 TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA - Organizzazione temporale (in 3 tempi) con: immediati precoci (CHX insensibili) Precoci ritardati (CHX sensibili) Es. HERPESVIRUS Replicazione del DNA mRNA precoci mRNA tardivi Proteine strutturali

9 9 DNA ds circolare (5.2 kbp) legato a istoni cellulari (H2A, H2B, H3 e H4) Capside icosaedrico nudo VP1, VP2 e VP3 geni precoci replicazione DNA geni tardivi Espressione temporale mRNA E e L trascritti in modo divergente a partire da ORI (45 nm)

10 10 tardive : proteine strutturali (VP1, VP2, VP3) - regolano la loro stessa sintesi transizione della trascrizione da precoce a tardiva - attivano lespressione dei geni tardivi - essenziale per la replicazione del DNA virale interazione con pRB e p53 (induzione della fase S nella cellula ospite ed inibizione dellapoptosi cellulare Proteine di SV40 precoci : proteine T e t ( regolatorie e multifunzionali)

11 11 Replicazione del Genoma di SV40 sito di origine della replicazione (ORI) la replicazione del DNA è bidirezionale (replicazione a Theta) ORI = sequenza unica Terminazione della sintesi del DNA a 180 o da ORI ( congiunzione delle forche di replicazione) 2 esameri di proteina T legano un sito (sito II) della ORI proteina T (elicasi) insieme a RpA cellulare (proteina di legame ssDNA) srotolano il DNA in modo da permettere la sintesi bidirezionale del DNA

12 12 DNA ds circolare (8 kbp) legato a istoni cellulari Capside icosaedrico nudo (L1,L2) Specie-specifici Tropismo per cellule dellepitelio squamoso Infezione produttiva solo in cellule epiteliali differenziate >100 tipi di HPV (Human Papilloma Virus) alto rischio: HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45 (55 nm)

13 13 PAPILLOMAVIRUS 7 geni E 2 geni L ( L1 e L2 strutturali) E6 si lega a p53 : segnale per ubiquitina e degradazione E7 attiva la proteina Rb

14 14 I PAPILLOMAVIRUS: il ciclo virale

15 15 Proteine Virali E2: fattore regolatore della trascrizione e della replicazione del DNA virale. E1: fattore importante per la replicazione del DNA virale, si lega allorigine di replicazione posto nel LCR E4: e espressa come gene late. Overlaps E2, ma ha un differente ORF. Viene sintetizzata contemporaneamente alla relicazione del DNA, prima della sintesi di L1 ed L2 E5: è altamente idrofobica, associata a membrane cellulari. Sembra induca una down regulation del sistema MHC E6: oncogene virale, interagisce con p53 E7: oncogene virale, interagisce con pRb

16 16 Capside icosaedrico nudo nm Circa 100 sierotipi umani Infezioni respiratorie ed enteriche Congiuntiviti acute infezioni latenti nel tessuto linfatico di tonsille, adenoidi e placche del Peyer (alcuni tipi oncogeni per roditori neonati) isolati da adenoidi umane

17 17 ADENOVIRUS Genoma: dsDNA lineare ITR (30-35 Kbp) ITR = Inverted Terminal Repeat Terminal protein P55 5 desossicitosina

18 18 Espressione del genoma Geni precoci = E1a, E1b, E2a, E2b (DNA pol), E3, E4 Geni tardivi = L1, L2, L3, L4, L5 (proteine strutturali) ADENOVIRUS

19 19 From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press 3. lelica di DNA dislocata forma un panhandle via gli inverted terminal repeats 4.associazione Pol-pre-TP e …… 1. la Polimerasi virale forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP il legame di Nf-1 e Oct-1 alla sequenza core Ori facilita la formazione del complesso 2. il 3OH di dCMP serve da innesco per la sintesi (in continuo) del filamento di DNA complementare Ad ssDBP (E2), e Topoisomerasi 5. sintesi (in continuo) del filamento complementare Adenovirus: replicazione del DNA lineare la PROTEINA TERMINALE funge da PRIMER

20 20 SottofamigliaGenere Tipo Alphaherpesvirinae Simplexvirus Herpes simplex virus tipo 1 Herpes simplex virus tipo 2 Varicellovirus Virus Varicella Zoster Betaherpesvirinae Cytomegalovirus Citomegalovirus Roseolovirus Herpesvirus umano 6 Herpesvirus umano 7 Gammaherpesvirinae Lymphocrypto- virus EpsteinBarr virus Rhadinovirus o del sarcoma Herpesvirus umano 8 di Kaposi Capside icosaedrico con involucro 150 nm

21 21 Sequenze Uniche = U (L e S) Sequenze Ripetute = R (L e S), (T e I) Genoma di HSV-1 DNAds lineare (150 Kb)

22 22 Genoma del virus Herpes Simplex di Tipo 1 Il genoma lineare quando entra del nucleo della cellula ospite circolarizza per la presenza di sequenze presenti alle due estremità TR Il genoma viene trascritto ad opera della RNA polimerasi II cellulare

23 23 HSV-1:REPLICAZIONE DEL GENOMA proteine necessarie per la sintesi del DNA virale ORI binding protein (UL9) helicase/primase complex (UL5, UL8, UL52). DNA polymerase (UL30), DNA binding proteins (UL42, UL29, ICP8)

24 24 Modello di replicazione del DNA dei virus erpetici Cerchio rotante From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press 1. taglio della molecola circolare : 3-OH utilizzato come primer 2. la sintesi della nuova elica provoca la dislocazione dellelica complementare 3 e 4. sintesi in continuo della forma circolare e sintesi discontinua sullelica dislocata con formazione di concatameri di dsDNA Il taglio del DNA (sequenza terminale ripetuta a) congiuntamente al processo di incapsidamento del DNA genera i nuovi genomi virali lineari

25 25 CICLO DI REPLICAZIONE cascata di espressione genica assemblaggio e maturazione

26 26 Capside icosaedrico non-rivestito nm Parvovirus autonomi Dependovirus o Virus adeno-associati (AAV) : 1 molecola lineare DNAss Kb

27 27 Adeno-associati Ad Virus satelliti: Per replicare richiedono attiva replicazione cellulare o la co-infezione con un virus helper (adenovirus o herpesvirus) AAV

28 28 PARVOVIRUS: DNA lineare ss ( Kb) Sequenze terminali palindromiche Sequenze terminali filamento codificante: filamento(-) 115nt

29 29 PARVOVIRUS Regioni separate per: proteine non strutturali (gene NS1, gene rep) proteine strutturali (geni cap)

30 30 REPLICAZIONE DEL GENOMA DEI PARVOVIRUS rolling hairpin model REP78 reazione nicking necessaria per la risoluzione dei terminali. attività di elicasi essenziale per srotolamento della regione ITR +


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