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Analisi in silico per la ricerca di domini conservati di NRPSs batteriche in genomi eucariotici Università degli Studi La Sapienza ROMA Anno 2002/2003.

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1 Analisi in silico per la ricerca di domini conservati di NRPSs batteriche in genomi eucariotici Università degli Studi La Sapienza ROMA Anno 2002/2003 Pietro Buffa MASTER in BIO informatica Applicazioni BioMediche e Farmaceutiche. Direttore Master: Prof.ssa Anna Tramontano Relatore: Prof. Stefano Pascarella

2 Generalità sulle Non Ribosomal Peptide Syntetases, NRPSs Le NRPSs provvedono ad una sintesi peptidica differente da quella svolta dai ribosomi, essi si presentano generalmente come grossi enzimi multifunzionali con unorganizzazione molecolare di tipo modulare. Il modulo più semplice è composto da tre domini indispensabili per il corretto funzionamento dellenzima: Dominio di Adenilazione Dominio di Tiolazione Dominio di Condensazione Catalizza lattivazione dellaminoacido (aminoacil-adenilato). Lega laminoacido al gruppo prostetico di fosfopanteteina (PP), formando un aminoacil-tioestere. Catalizza lallungamento del peptide nascente.

3 Diversi studi condotti sul dominio di Adenilazione di questa famiglia di enzimi hanno dimostrato che: La natura del substrato che sarà inserito nel peptide sintetizzato dalle NRPSs è controllata principalmente da questo dominio. La presenza di un aminoacil-adenilato è la necessaria premessa alla formazione dellaminoacil-tioestere nel dominio di Tiolazione e quindi alla sintesi del peptide. La presenza di un aminoacil-adenilato è la necessaria premessa alla formazione dellaminoacil-tioestere nel dominio di Tiolazione e quindi alla sintesi del peptide. Studi condotti su oltre 150 domini di Adenilazione provenienti da organismi diversi, hanno rivelato la presenza di importanti residui conservati coinvolti nel legame e nellidrolisi dellATP. Sulla base di queste osservazioni è oggi possibile prevedere la specificità di un dominio di adenilazione a partire dalla struttura primaria con una accuratezza di circa l86% (Stachelhaus et al, 1999). Studi condotti su oltre 150 domini di Adenilazione provenienti da organismi diversi, hanno rivelato la presenza di importanti residui conservati coinvolti nel legame e nellidrolisi dellATP. Sulla base di queste osservazioni è oggi possibile prevedere la specificità di un dominio di adenilazione a partire dalla struttura primaria con una accuratezza di circa l86% (Stachelhaus et al, 1999). Nel 1997 Mohamed Marahiel della Philipps university of Marburg ha ottenuto la struttura cristallografica del dominio di Adenilazione della Gramicidina sintetasi di Bacillus brevis. Nel 1997 Mohamed Marahiel della Philipps university of Marburg ha ottenuto la struttura cristallografica del dominio di Adenilazione della Gramicidina sintetasi di Bacillus brevis. La struttura cristallografica, lunica fino ad oggi risolta, è stata ottenuta con i substrati complessati, rispettivamente la L-Phe e AMP ad una risoluzione di 1,9Å. In giallo il dominio maggiore, in rosso il dominio minore. AMP e Phe sono mostrati come modelli a spazio pieno.

4 SCOPO DEL LAVORO Punto di partenza di questa ricerca è stata la recente identificazione da parte di due ricercatori Giapponesi (T. Kasahara e T. Kato, Nature 2003) di una importante molecola: la Pirrolo Quinolina Quinone (PQQ), cruciale per la degradazione dellaminoacido Lisina da parte di particolari deidrogenasi PQQ-dipendenti nel topo (acido 2-aminoadipico 6- semialdeide deidrogenasi AAS). Queste deidrogenasi, presentano una organizzazione dei domini che è tipica degli enzimi NRPS di origine batterica: Dominio di Adenilazione legante AMP Dominio di Tiolazione legante PP Ed un Dominio legante il PQQ Scopo della ricerca è quello di verificare se proteine contenenti i domini AMP e PP compaiono anche in altri organismi (oltre che in Topo e Drosophila dove sono stati recentemente riscontrati) e se si, associati a quale altro dominio.

5 RISULTATI DELLA RICERCA Ricerca di nuove sequenze proteiche correlate alle NRPSs batteriche in diversi genomi eucariotici Una preliminare ricerca sulle banche dati proteiche, ha permesso di individuare 15 proteine correlate alle NRPSs batteriche (contenenti cioè i domini fondamentali), non ancora annotate nella loro funzione in banca dati. Sono state utilizzate come sonda le proteine: AAS (Acido 2-aminoadipico 6-semialdeide deidrogenasi) di topo [Accession number, ] U26 di Drosophila [Accession number, AAF52679] EBONY di Drosophila [Accession number, CAA11962] CODICE Seq.ORGANISMODOMINILUNG Prot. In SILICO Nr:GI_ A. thaliana AMP-PP-WD40(PQQ) 1175NO Nr:GI_ A. thaliana AMP-PP-WD40(PQQ) 1040NO Nr:GI_ A. thaliana AMP-PP-WD40(PQQ) 1040NO Nr:GI_ C. elegans C-AMP-PP-C-PP-C-AMP-P 2870NO Trembl :q95q02C. elegans AMP-PP-PP-C-AMP-PP 2870NO Nr:GI_ C. elegans AMP-PP-WD40(PQQ) 707NO Nr:GI_ C. elegans AMP-PP-WD40(PQQ) 714NO Nr:GI_ D. melanogaster AMP-PP- ? 703NO Nr:GI_ D. melanogaster AMP-PP- ? 879NO Nr:GI_ D. melanogaster AMP-PP- ? 879NO Nr:GI_ D. melanogaster AMP-PP-PQQ 1012NO Nr :GI_ D. melanogaster AMP-PP- ? 879NO Nr:GI_ D. melanogaster AMP-PP-PQQ 824NO Nr:GI_ A. gambiae AMP-PP-? 881NO Nr:GI_ A. gambiae AMP-PP-PQQ 824NO

6 Le sequenze precedentemente elencate sono state utilizzate come sonda per ricerche di similarità sulle Banche Dati Genomiche utilizzando il modulo tblastn del programma BLAST implementato sia su NCBI che su ENSEMBL. R. Norvegicus (Rat) M. Musculus H. Sapiens D. Melanogaster C. Elegans C. Briggsae A.Thaliana D. Rerio (Zebrafish) A.Gambiae S. Scrofa G. Gallus B. Taurus C. Intestinalis F. Rubripes O. sativa Per alcuni genomi non si sono avuti risultati positivi. Per altri si è trovata una notevole similarità e la presenza di residui chiave veniva mantenuta. Per queste sequenze si è proceduto allesportazione delle rispettive sequenze genomiche in formato FASTA.

7 Costruzione di geni in silico per le sequenze ritrovate in seguito alle ricerche genomiche ORGANISMOCODICE SEQUENZ A SONDA LOCALIZZAZIONE GENOMICA LUNGHEZZA PROTEINA Crom.14 Contig: RNOR AA Crom. 4 Contig:AC AA Danio Rerio (zebrafish) Contig: CTG AA Fugu Rubripes Scaffold: AA Ciona Intestinalis AABS _ AA Oryza sativa Nr:GI_ AA Oryza sativa Nr:GI_ AA Oryza sativa Nr:GI_ AA Homo Sapiens Rattus norvegicus Le sequenze genomiche precedentemente esportate e salvate vengono utilizzate in questa seconda fase del lavoro, per cercare di ottenere, attraverso luso di programmi quali GenScan e genomeScan, una corretta costruzione del gene specifico per ogni sequenza ed arrivare alla fine, alla predizione della relativa sequenza proteica completa.

8 Realizzazione di un allineamento multiplo completo – Parte dellallineamento multiplo di 35 sequenze proteiche appartenenti alla famiglia della NRPSs,. Lallineamento è stato formattato utilizzando il programma ESPRIT 2.1. Abbiamo utilizzato 35 sequenze Da tutte le 35 seq. È stata manualmente eliminata la regione contenente il dominio C-terminale E stato utilizzato il programma HMMERalign Sono state eliminate dallallineamento multiplo le regioni iniziali e terminali poichè non avendo corrispondenze ben definite, potevano creare un fastidioso rumore di fondo che andrebbe a disturbare la successiva fase di generazione dellalbero evolutivo DFFxxLGG(HD)S(LI) Residui fondamentali del dominio di tiolazione. La serina lega il gruppo prostetico di fosfopanteteina.

9 Realizzazione dellalbero filogenetico Albero filogenetico. Sono stati utilizzati i programmi: PROTDIST KITSCH e DRAWTREE Linea filetica dei Batteri Linea filetica dei Funghi Linea filetica dei Vegetali Linea filetica degli organismi eucariotici superiori animali

10 Il completamento in corso di vari progetti gnomici ha permesso di individuare numerose proteine correlate alle NRPSs batteriche in organismi eucariotici superiori non ancora annotate in banca dati. La conoscenza del sistema sintetico delle NRPSs e la comprensione più approfondita dellevoluzione che queste proteine enzimatiche, conosciute fino a poco tempo fa soltanto a livello batterico, potrebbero avere avuto, potrebbe risultare utile per cercare di far luce su determinate vie metaboliche non ancora molto chiare in diversi organismi superiori. DISCUSSIONE

11 RINGRAZIAMENTI


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