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Ciclo di Calvin. The Calvin Lollipop for exposing algae to 14 CO 2.

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Presentazione sul tema: "Ciclo di Calvin. The Calvin Lollipop for exposing algae to 14 CO 2."— Transcript della presentazione:

1 Ciclo di Calvin

2 The Calvin Lollipop for exposing algae to 14 CO 2

3 Esperimenti di marcatura (pulse and chase) hanno messo in evidenza che il primo composto dove viene incorporata la CO 2 radioattiva è un C3 (il 3-PGA, acido 3-fosfoglicerico) Come inizia la fotosintesi? La marcatura si sposta molto velocemente su diversi altri composti (la vita media è bassa) problemi di rifornimento

4 Il ciclo di Calvin è suddiviso in tre fasi:

5 RuBP + CO 2 2 x 3-PGA Ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) OH H 2 C CH C C OHH H 2 COPO 3 2- OPO 3 2- O OH H 2 C CH C OO OPO phospho- glycerate Rubisco C5 + C1 = 2 x C3

6 Carbossilazione/Riduzione

7 Fase di riduzione OH H 2 C CH C OO OPO 3 2 OH H 2 C CH C OPO 3 2 O OPO 3 2 OH H 2 C CH CHO OPO 3 2 ATP ADPNADPH NADP + P i 1,3-bisphospho- glycerate 3-phospho- glycerate glyceraldehyde- 3-phosphate Phosphoglycerate kinase Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase ATP e NADPH sono prodotti nella fase luminosa Il carbonio carbossilico è ridotto a carbonile (aldeide)

8 Rigenerazione 2 GAP diventano F1,6P e poi F6P

9 Rigenerazione (2) F6P + GAP = Xilulosio5P + Eritrosio5P Eritrosio5P + GAP = Sedoeptulosio1,7BP

10 Rigenerazione (3) Sedoeptulosio7P + GAP = R5P + Xylulosio5P

11 Bilancio del ciclo Per ogni CO 2 vengono prodotte due molecole di 3-PGA –2 x ATP –2 x NADPH 2 elettroni per NADPH 2 fotoni per elettrone 2x2x2 = teoricamente 8 fotoni per CO 2 (se ATP è prodotto in quantità sufficiente) 1 ATP aggiuntivo per ogni CO 2 richiesto nella reazione della Fosforibulokinasi 3 CO ATP + 6 NADPH + 6 H H 2 O C 3 H 6 O 3 -P + 9 ADP + 8 P i + 6 NADP H 2 O + 3 O 2

12 Bilancio energetico per 1 Glucosio-P I prodotti della fase luminosa quanta energia possiedono? –18 x ATP e 12 x NADPH Corrispondono a quanti Joule? In totale: 3126 kJ/mol 18 x 29 kJ/mol 12 x 217 kJ/mol Quanta energia in 8 moli di fotoni di luce rossa (x 6 CO 2 )? 6 x 8 x 175 kJ/mol = 8400 kJ 6 CO ATP + 12 NADPH + 12 H + C 6 H 12 O 6 -P + 18 ADP + 17 P i + 12 NADP H 2 O Quanta energia deriva dalla combustione di una mole di esoso? 2804 kJ (ed è la quantità minima richiesta per sintetizzarla)

13 Efficienza Energia ricavata / energia investita 3126 / 8400 = 33 % Efficienza della fotosintesi 2804 / 3126 = 83 % Efficienza del Calvin

14 Tappa Enzima ΔG° (kJ/mol)ΔG (kJ/mol) 1Fosforibulo kinasi (PRK) RuBisCO PGlyKinasi + GAP-DH TriosoP isomerasi Aldolasi Fruttosio BPasi Transketolasi Aldolasi Sedoeptuloso BPasi Transketolasi PentosoP isomerasi RibosioP isomerasi * * * * * * * * La termodinamica del ciclo di Calvin Alcune reazioni mostrano un differenza in energia libera molto grande e negativa e saranno spostate decisamente verso i prodotti Secondo la biochimica classica queste sarebbero le reazioni che regolano il flusso

15 Rubisco ID card Enzima composto da 8 subunità grandi e 8 subunità piccole (L 8 S 8 ) Subunità L codificata dal genoma plastidiale e porta il sito attivo (allinterfaccia tra due subunità L) Sububità S codificata dal genoma nucleare e non catalizza la reazione (nessun residuo partecipa al sito attivo)

16 Figure 8.2.A A model for the structure of rubisco in chloroplasts from higher plants. Rubisco consists of 8 large (L) and 8 small (S) subunits arranged as 4 dimers. Small subunits are shown in red (only four of the small subunits are seen), large subunits are shown in blue and green, in order to show the boundaries of the dimers. (From Malkin and Niyogi 2000.) L S L Altre 4 subunità S si trovano dallaltra parte

17 RuBP Carboxylase – meccanismo postulato: Estrazione di un H + dal C 3 del ribulosio-1,5-bisfosfato promuove la formazione di un intermedio enediolato. Un attacco nucleofilo sulla CO 2 porta alla formazione di un intermedio -keto acido, che reagisce con acqua per formare 2 molecole di 3-phosphoglycerate.

18 I due substrati sono simili (lineari e con una estremità identica) per cui è difficile discriminare La molecola di O 2 risulta più piccola di CO 2 per cui è difficile che non entri nel sito attivo La Rubisco in realtà catalizza due diverse reazioni

19 Perchè unattività apparentemente dannosa? Lattività ossigenasica della Rubisco è un male evitabile? (Occorrerebbe quindi solo cercare varianti dellenzima capaci di discriminare meglio tra i due substrati). Oppure lattività è inevitabile (dal punto di vista catalitico) o addirittura necessaria perché svolge qualche funzione importante? E probabile che sia inevitabile e ultimamente utile: inevitabile perché la CO 2 è molto meno abbondante dellO 2

20 Gas P (aria)Conc (aria)Conc (H 2 O)Conc in H 2 O al p.c. CO 2 CO μbar16 μM11.7 μM1.5 μM O2O2 210 mbar9.4 mM265 μM Concentrazione dei gas a 25°C La CO 2 pur essendo a bassa concentrazione nellaria, si arricchisce (scioglie preferenzialmente) nellacqua 210/0.35 = /11.7 = 22.6

21 Come varia [CO 2 ] con la temperatura? [CO2] (in μM) = P p. CO2 α 10 6 /22.4 α = α (T) Allaumentare della temperatura, la solubilità di O 2 e CO 2 scende, ma quella della CO 2 scende più velocemente

22 Ciclo fotorespiratorio Immagini da: Buchanan et al. Biochemistryy and Molecular Biology of Plants Il ciclo fotorespiratorio è un ciclo parassita!!

23 Ciclo fotorespiratorio Compartimenti, enzimi e reazioni Glutamate synthase (GOGAT-glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase)

24 Cosa succede se blocchiamo il ciclo? Es. mutanti nella Glutammato Sintetasi cloroplastica (Fdx dipendente) crescono ad alta CO 2 ma non in aria (clorosi). Mutanti alterati negli enzimi del ciclo accumulano gli intermedi e hanno un fenotipo caratteristico Nella fotorespirazione si accumula NH 3

25 Esempi di mutanti che richiedono alta CO 2 : Phosphoglycolate phosphatase Catalase Serine trans-hydroxymethylase Dicarboxylic acid translocator Glu synthase Gln synthase Ser/Glyox amino transferase Rubisco Attivasi I mutanti mostrano tutti clorosi a [CO 2 ] ambientale. La semplicità dello screening (clorosi in aria, ma non ad alta CO 2 ) ha permesso lisolarmento di molti mutanti. E stato di fatto lisolamento e lo studio dei mutanti che ha permesso di delucidare il ciclo fotorespiratorio Il ciclo PR è necessario per riciclare il fosfoglicolato & intermedi

26 Che peso ha in vivo la fotorespirazione? Per temperature superiori ai 30°C, lassimilazione netta può diminuire del 60% per una pianta C3 [CO 2 ] (ppm) 21%O 2 2%O Assimilazione netta in funzione di [CO 2 ] e [O 2 ] Valore vicino a quello naturale La differenza è imputabile alla fotorespirazione

27 Come avviene la competizione tra CO 2 e O 2 ? Il valore di Km viene aumentato: K m =K m (1+I/K i )= K m α Linibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato La competizione tra CO 2 e O 2 per il complesso Rubisco-enediolato si traduce in cinetica standard di inibizione competitiva tra i due gas

28 La V m nellinibizione competitiva è la stessa!!!

29 Poniamo: C = [CO 2 ] O = [O 2 ] V c = V max Carbossilazione V o = V max Ossigenazione K c = K m CO2 = K I Oss. K o = K m O2 =K I Carb.

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31 Fattore di specificità relativo S rel (φ) Se riusciamo a calcolarci v c /v o per un dato rapporto di CO 2 /O 2, allora riusciamo a ricavare il valore di S rel (indicato come φ nel libro) che sarà poi utilizzabile come costante. A=d[CO 2 ]/dt = 0 A = Assimilazione = v c - 0.5v o - R d Quando A=0 siamo al punto di compensazione della CO 2 Per ogni RuBP ossigenato si libera una glicina e quindi solo 0.5 molecole di CO 2 La respirazione al buio (Rd, Dark Respiration) è in genere bassa alla luce (e comunque difficile da misurare quando la fotosintesi funziona) per cui si trascura.

32 Punto di compensazione della CO 2 Assimilazione Punti di compensazione della CO 2 (per una C4 e una C3 rispettivamente)

33 Trascurando Rd e con A=0 abbiamo: v c = 0.5 v o v o = 2 v c Quanto vale la [CO 2 ] al punto di compensazione? Vedi diapositive 18 e 19[CO2] (in μM) = P p. CO2 α 10 6 /22.4 =1.5

34 In vivo: Se la Rubisco funzionasse in aria: Su 8 eventi: 7 Ossig. e 1 Carb. In acqua in equilibrio con aria (0.035%): In acqua al p.c. CO 2 (0.0045%):

35 Valori di S rel

36 Cè una relazione tra S rel e K cat ? Rubisco is surprisingly inefficient (K cat =2-8 s -1 ) S rel varies between 20 and 280 ( for higher plants) A trade off: aumentare la velocità della reazione comporta una perdita di specificità Quanto più lenediolo nel sito attivo è in una configurazione contorta, tanto più la reazione è specifica per la CO 2 e tanto più è difficile rilasciare i prodotti (enzima lento) Vedi Tcherkez et al. (2006) PNAS 103:

37 Regolazione della Rubisco Lattività della Rubisco viene regolata a diversi livelli: * Quantità di enzima sintetizzato * Stato di attivazione (Rubisco attivasi, regolata a sua volta) * Presenza di inibitori … * Anche la disponibilità dei substrati influenza la reazione Lattività della Rubisco (e di diversi altri enzimi) deve essere regolata, altrimenti… I substrati tendono a scomparire e i prodotti ad accumularsi

38 Stato di attivazione della Rubisco La Rubisco presente in cellula non è attiva al 100% ma solo in parte Può essere attivata incubando con alta CO 2 e Mg ++ (attività totale) La % di attivazione cambia in base a fattori ambientali (illuminazione, disponibilità di acqua…)

39 Carbamilazione della RuBisCO La RuBisCO viene attivata per carbamilazione di un residuo di lisina da parte di una molecola di CO 2 che non interagisce con il sito attivo; la reazione viene favorita da [H + ] bassa e [Mg ++ ] alta. Lys 201 (spinacio) La reazione è favorita dalla pesenza di Rubisco attivasi

40 RuBisCO attivasi La RuBisCO attivasi aiuta il rilascio del substrato (o di inibitori) che impediscono la carbamilazione. La reazione è ATP dipendente

41 Valori: (stroma) BuioLuce pH Mg Trdx (% red) La reazione è favorita alla luce Quando aumenta la luce la Rubisco viene attivata

42 La CO 2 agisce sia da attivatore (modulazione) o da substrato (catalisi) per la rubisco Forma attiva Forma inattiva

43 Transition state analogs of the postulated -keto acid intermediate bind tightly to RuBP Carboxylase and inhibit its activity. Il 2-carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate (CABP) Alcune piante sintetizzano al buio degli inibitori della Rubisco. Sono analoghi dello stato di transizione, (es. CABP o carboxyarabinitol-1-phosphate CA1P). La Rubisco attivasi facilita il rilascio di CA1P dalla Rubisco, quando viene attivata in condizioni di illuminazione dal sistema della tioredossina. Intermedio di reazione Analogo dellintermedio di reazione CABP

44 La regolazione tramite sulfidrili Enzimi regolati tramite Tioredossina: FBPasi SBPasi PRK NADP-GAPDH Rubisco Attivasi NADP-MDH CF1-ATPasi Phe-ammonia lyase ADP-G PPasi G6P-DH PFK? +

45 Ciclo fotorespiratorio Il ciclo produce H 2 O 2 che deve essere detossificata la catalasi è necessaria per il ciclo Il ciclo produce NH 3 che deve essere detossificata (è un disaccoppiante) la Glutamina Sintasi (come la Glutamato Sintasi) è necessaria per il ciclo

46 Cosa succede in assenza di CO 2 e con poco ossigeno alla catena di trasporto degli elettroni? 2% O 2 21% O 2 Lossigeno aiuta a sostenere a catena di trasporto degli e - in assenza di CO 2 Kozaki e Takeba (1996) Nature 384: Le piante differiscono per lattività della Gln sintasi e quindi per la capacità fotorespiratoria (la GS serve per reincorporare lammoniaca) Il trasporto fotosintetico di elettroni viene ridotto drasticamente In assenza di CO2 e con poco ossigeno la FR funziona poco e quindi il consumo di ATP e di NADPH è molto ridotto

47 La fotorespirazione conferisce un vantaggio (i mutanti che ne sono privi infatti muoiono) in condizioni di CO 2 limitante FreddoCaldo La fotorespirazione mantiene attiva la catena di trasporto degli elettroni in assenza di CO 2 O 2 riceve gli e - in assenza di CO 2

48 Three pathways cooperate in the metabolism of P-glycolate in Synechocystis: a plant-like C2 cycle, a bacterial-like glycerate path and a decarboxylation pathway Photorespiration redesigned Kebeish et al., (2007) Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nat Biotechnol. 25:593-9.Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Più che sulla eliminazione della FR conviene puntare su un ciclo più corto: piante che contengono gli enzimi 10 e 12 riciclano il gliossalato più efficientemente plant-like C2 cycle

49 Bibliografia * Kozaki e Takeba (1996) Photorespiration protects C3 plants from photooxidation Nature 384: Introduz. generale: Buchanan, Gruissem & Jones (2001) Biochemistry and Molecular Biology of Plants capitoli 8 (glutamato sintasi, p ) e 13 Rubisco e il calvin: Rubisco e fattore di specificità vedi: roni%20en%20PDF/14%20Chapter10.%20Biochemistry%20of%20Rubisco.pdf * Tcherkez et al. (2006) PNAS 103: * Griffith (2006) Nature 441:


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