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S e J: proprietà sistemiche * Le questioni del controllo non possono essere trattate guardando solamente allo stadio isolato. * Ciascuna variabile (metabolita.

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1 S e J: proprietà sistemiche * Le questioni del controllo non possono essere trattate guardando solamente allo stadio isolato. * Ciascuna variabile (metabolita o flusso) non è determinata da un singolo stadio ma dipende in generale da tutti, magari in maniera diversa. Come possiamo formalizzare questo in maniera quantitativa? * Se vogliamo risposte quantitative dobbiamo porre domande quantitative Se il RLS non va bene con cosa possiamo sostituirlo?

2 Le vie metaboliche Serie di intermedi metabolici (A,B,C…) collegati tra di loro da enzimi (E 1, E 2 …). Nel mare magnum delle possibili reazioni a cui i metaboliti possono dare luogo, la specificità e peculiarità della catalisi enzimatica permettono, rispettivamente, una selezione molto ristretta e condizioni molto blande di reazione. E1E1 E2E2 E3E3 E4E4 Le quantità di enzima e le relative leggi cinetiche determinano i flussi

3 Come descrivo in termini quantitativi una via metabolica? Definire la via metabolica e i suoi confini Cercare leggi cinetiche adeguate per tutti gli enzimi/processi Scrivere il sistema di equazioni che, una volta risolte, portino a esprimere le variabili (ad es. la concentrazione dei metaboliti o il flusso) in funzione dei parametri del sistema e del tempo J = f(A, B, P 1, P 2, X 1,X 2, t…)

4 Una via metabolica: qualche concetto in più X 0 S 1 S 2 S 3 ….. X 1 E 1 E 2 E 3 E 4 … E n Attenzione: vie ramificate, cicliche con cofattori… n enzimi (ciascuno con la sua legge cinetica) e.g. v E 2 = f (A 1, A 2, A 5, V max E2 …) n -1 substrati 2 metaboliti esterni (X 0 and X 1 )

5 Come impostare (e risolvere) il problema? = volume Equazione per S 2 : Ricordate che il volume delle cellule può variare! (per crescita, con o senza divisione cellulare) G: tasso di crescita (dV/dt)/V

6 Se fate lo stesso per tutti i metaboliti (scrivere unequazione) arrivate ad un insieme di equazioni non lineari Per S 2 vale la relazione: (dS 2 /dt) = v 2 - v 3 - GS 2 (dS 2 /dt) = v 2 - v 3 - GS 2 (dS 3 /dt) = v 3 – v 4 - GS 3 (dS 4 /dt) = v 4 - v 5 - GS 4 …..e così via Allo steady state = 0 (flusso costante) e con G=0 (la cellula/ tessuto non cresce di volume), il sistema si semplifica 0 = v 2 - v 3 0 = v 3 – v 4 0 = v 4 – v 5 ….. e così via (in presenza di diramazioni la cosa si complica)

7 Cè bisogno di strumenti adeguati per affrontare il problema; inizieremo con un breve ripasso delle cinetiche enzimatiche. E possibile scrivere il sistema, ma non è facile risolverlo! Perché v = f (E 2, S 2, S 3, P 1, P 2, X 0, X 1 …) cioè funzione della concentrazione di substrati e prodotti, della quantità di enzima, della temperatura, dei metaboliti esterni (distinzione tra parametri e variabili) Provando a risolvere il sistema…

8 Quanto un parametro influenza un flusso? Come varia il flusso se vario la quantità di enzima? Poco o tanto? Quanto varia il flusso se vario la quantità di enzima? X 0 S 1 S 2 S 3 ….. X 1 E 1 E 2 E 3 E 4 … E n v 1 v 2 v 3 v 4 … v n Per spiegare il controllo del flusso abbiamo bisogno di introdurre il concetto di elasticità, una proprietà locale

9 Elasticità o ordine di reazione Breve introduzione allelasticità Occorre meditare sui concetti e rileggere la letteratura

10 Elasticità (ε) Lelasticità è una proprietà locale e ci dice come varia la velocità di un enzima al variare della concentrazione di un metabolita con cui lenzima interagisce (S, P, I,…) Viene anche definita come ordine di reazione E la pendenza sul grafico v funzione di S (e ci si aspetta che sia funzione di S) quando la scala è logaritmica. ΔS ΔvδS δv La differenza può essere grande (Δ) o piccola (δ)

11 Siccome la variabile è, in questo caso, il substrato (S), allora si parla di elasticità al substrato. Elasticità: coefficiente angolare nello spazio logaritmico Il coefficiente angolare si ottiene passando al limite...

12 Elasticità al substrato per una MM irrev. ε S/K M Provate a esercitarvi con vExplorer

13 Elasticità e derivata prima Elasticità Derivata prima v, v ' o ε S/K M e a P?

14 Potete arrivare lo stesso risultato derivando la formula di MM? Lelasticità varia tra 1 e 0 (corrispondenti a S=0 e infinito) Prova prima a risolverlo, altrimenti vai a vedere

15 Elasticità al substrato per una MM rev. Lelasticità varia tra + infinito e – infinito; (attenti a v= 0) Come si ricava? ? Cosa succede?

16 Elasticità e derivata prima MMrev ElasticitàDerivata prima vv

17 Lelasticità al substrato di un enzima reversibile possiede due componenti: * Una di natura termodinamica che dipende da quanto la reazione è spostata dallequilibrio * Una di natura cinetica che dipende da quanto lenzima è saturato rispetto al substrato (prodotto) Lelasticità distingue tra i contributi termodinamici e cinetici in maniera additiva (invece che moltiplicativa) come accadeva per lespressione della velocità Prova a ricavarlo! (soluzione…)

18 Un enzima può possedere diversi tipi di elasticità Elasticità al prodotto Elasticità al substrato Elasticità alla quantità di enzima, attivatori, inibitori…

19 Quanto più lontana è una reazione dallequilibrio tanto maggiore è il potenziale per la regolazione Il termine cinetico è la chiave della regolazione Quando ρ 1 (siamo vicini allequilibrio) questo termine assume valori molto grandi Quando ρ 0 (siamo lontani dallequilibrio) questo termine diventa significativo

20 Elasticità al substrato per un enzima cooperativo Usando lequazione di Hill con n=2, lelasticità varia 0 e 2

21 Derivazione della formula per lelasticità al substrato (enzima tipo MM irrev.) Lelasticità è indipendente da V M

22 Derivazione di ε s per un enzima reversibile Ricordando che le espressioni cinetiche possono essere scritte spesso come (numeratore/denominatore)

23 Come semplificare le derivate

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26 Lelasticità al substrato di un enzima reversibile possiede due componenti: * Una di natura termodinamica che dipende da quanto la reazione è spostata dallequilibrio * Una di natura cinetica che dipende da quanto lenzima è saturato rispetto al substrato (prodotto) Ritorna al grafico ε s Derivando lelasticità per il prodotto si trova:

27 Flux Control Coefficient (C J ) Cosa sono, a cosa servono e come posso misurarli X 0 S 1 S 2 S 3 ….. X 1 E 1 E 2 E 3 E 4 … E n v 1 v 2 v 3 v 4 … v n Operiamo una variazione nellenzima E 2, quale sarà la variazione di J corrispondente? Se siamo allo steady state, v 1 = v 2 = v 3 = v 4 = v n = J

28 ΔE 2 ΔJ δE 2 δJ Operando una variazione piccola di J (ma sufficiente per una misura affidabile) ci avviciniamo alla derivata della curva J= J(E 2 ) Misura di C J

29 Per misurare C J con precisione occorre fare piccole variazioni nella quantità di un enzima (e uno solo!!) Questo non è sempre fattibile dal punto di vista sperimentale Per ogni flusso (reazione), ci sono tanti C J quanti enzimi; (se ci sono più flussi…) Il tipo di definizione è simile a quella dellelasticità, ma il C J non è una proprietà di tipo locale, bensì di tipo sistemico

30 Che forma avrà la curva J(E)? A valori bassi di E A valori alti di E

31 Derivata e derivata con scaling

32 C J in un grafico log-log In questa zona la pendenza è 45% cioè il coeffic. Angolare (che è il C J ), è 1

33 La relazione enzima flusso in un caso reale:

34 % reduct. Aldolase % inhibit. Photosynt Photosynthesis (Calvin cycle) Haake et al. (1998) Plant J. 14: C J aldolase in wt 0.24 (normal conditions) Reduction of plastidial aldolase (reaction close to equilibrium) Light 400 μmol/m 2 *s Enzyme (% wt) Laldolasi plastidiale è un enzima che lavora vicino allequilibrio ma che è limitante

35 Light at 220, 350, 700 μE ConditionC J TK for wt plants CO 2 amb., light at 220 μE 0.14 CO 2 amb., light at 700 μE 0.32 Reduction of plastidial transketolase (reaction close to equilibrium) La transketolasi è un enzima che lavora vicino allequilibrio ma che è limitante

36 C J Rubisco = 0.1 in wt conditions Rubisco (%) (wt) V max Activation % Assimilation Rubisco La Rubisco è un enzima che lavora molto lontano dallequilibrio e che NON è limitante

37 Flux control in photosynthesis A significant share of flux control is in enzymes close to equilibrium Highly regulated enzymes working far from equilibrium show less flux control When light is switched on, flux increases: many reactions are activated through changes in pH, Mg 2+, redox status (thioredoxins), carbamylation, inhibitor degradation… Attivazione parallela (no sign for a RLS!)

38 Biosintesi del Triptofano in Saccharomyces cerevisiae: 5 enzimi trasformano lAcido Corismico in Triptofano Una via metabolica reale: biosintesi di Trp in lievito

39 AAS (TRP2)PRT (TRP4)PRAI (TRP1) TrpS (TRP5)InGPS (TRP3) A rigore le variazioni dovrebbero essere piccole…

40 Due conclusioni importanti - I valori di C J in vivo, nelle condizioni wt, sono bassi - Incominciano a salire solo per riduzioni notevoli della quantità di enzima (<50%) La figura testimonia due fatti:

41 * La sovraespressione non porterà un grande (quanto?) aumento nel flusso! * Molti enzimi hanno un C J basso per cui una buona parte dellattività di ciascuno di essi è dispensabile e questo significa che molte mutazioni sono recessive! * Easy: Stopping flux to a product through a pathway. (Pick any enzyme; knock out by mutation or inhibition). * Hard: Increasing flux to a product through a pathway. Flux change: an asymmetric problem

42 Verifica sperimentale della prima conclusione Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔE i (ΔJ C J x ΔE i )

43 Alcune proprietà dei C J Facciamo un esperimento con il pensiero… aumentiamo lenzima E 1 di una quantità δE 1 es. incremento frazionario dell1% (δE 1 / E 1 )

44 Immaginiamo di fare lo stesso per tutti gli enzimi Otterremo un aumento di flusso δJ, la cui entità sarà: E1E1 E2E2 E3E3 E4E4 E5E5 δE1δE1 δE2δE2 δE5δE5 δE3δE3 δE4δE4 δJδJ δJδJ δJδJ δJδJ δJδJ JJJJJ indica laumento di flusso determinato dallenzima 1

45 Teorema della somma A moment's reflection should show that such a change is equivalent to changing the time scale of the measurements: thus it should change all steady-state fluxes through the system by exactly a factor of α.

46 Se la somma di tutti i coefficienti C J deve valere 1, allora si spiega perché in una via metabolica molti (se non addirittura tutti) gli enzimi hanno un C J basso! Questo darebbe ragione della recessività dei geni (95%)!!! (nessuna spiegazione alternativa rende ragione dei dati) Phenotype is flux! (non sempre…)

47 A cosa servono i C J ? Ci permettono di predire il flusso in funzione della quantità di enzima. La bontà della predizione sarà tanto maggiore quanto più piccola sarà la variazione di enzima. Viene però usata di solito questa formula per predire le variazioni di flusso, perchè lapprossimazione è minore ΔEΔE ΔJΔJ E1E1 E2E2

48 Se il flusso dipende dalla quantità di enzima con la legge di uniperbole rettangola, …allora è possibile ricavare il C J anche quando avvengono grandi variazioni di E (cosa che in genere non si può fare) Si usano in pratica i valori di E e di J non di partenza, ma di arrivo Usando questa formula si può derivare una formula più generale per predire le variazioni di flusso in funzione dellentità della sovraespressione di un enzima: Note that this differs from the small-change estimate of the flux control coefficient in that the scaling factor is E 2 /J 2, not E 1 /J 1 (the ratio at the original operating point).

49 Quando r è grande Se sovrasprimo di 5 volte un enzima con C J di 0.6, basta usare la curva 5 (r = 5) e trovare dove incontra la retta x=0.6, il risultato sarà un flusso relativo f~2 f flusso relativo

50 Coefficienti di controllo delle concentrazioni Ci dicono come varia la concentrazione dellintermedio j-esimo (S j ) al variare della quantità di enzima i. Attenzione che non è linverso dellelasticità. E di nuovo una proprietà sistemica e ve ne sono in totale: (n enzimi) x (m substrati) j è lindice da far variare su tutti i substrati i è lindice da far variare su tutti gli enzimi

51 Definizione formale di C S Ci dice come varia la concentrazione di un metabolita al variare di un enzima. Proprietà sistemica: variando anche un solo enzima è possibile che cambino TUTTI i metaboliti variabili Esistono n x m C S (n reazioni, m metaboliti)

52 Se tutti gli enzimi aumentano in quantità (velocità) dello stesso fattore, quale sarà la variazione di S J ? Per i vari C S valgono relazioni analoghe al teorema della somma Vale 0!

53 Per ogni S la somma dei C S vale 0 Teorema della somma Che significato ha? Alcuni enzimi aumentano la concentrazione di S J Altri enzimi diminuiscono la concentrazione di S J

54 Referenze Per il concetto di elasticità, vedi Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap. 5; Vedi anche il cap. 10 di Fundamentals of Enzyme kinetics, di A. Cornish Bowden Go to chapter 10 Fundamentals of enzyme kinetics Ottima ed approfondita (anche sin troppo in certi capitoli) panoramica sulla MCA: Hofmeyr, Snoep and Westerhoff (2002) Kinetics, Control and Regulation of Metabolic Systems (disponibile da me il file Snoep+Westerhoff.pdf) Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys. Chem. B, 114:16280– Continua...

55 Referenze Articolo sulla via del Trp in Saccharomyces: Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287: Per il concetto di CJ e di elasticità: Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap. 5; vedi anche mrs.fr/bip10/mca3.htm#1 e mrs.fr/bip10/mca3.htm#1 Per la dimostrazione dei teoremi si veda anche la ristampa dellarticolo originale: Kacser, Burns, Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc. Trans. 23, Vedi anche il cap. 10 di Fundamentals of Enzyme kinetics, di A. Cornish Bowden Go to chapter 10 Fundamentals of enzyme kinetics


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