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Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA)

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Presentazione sul tema: "Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA)"— Transcript della presentazione:

1 Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

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3 Step 2: dalla trascrizione alla proteina 5 3

4 Gli enzimi sono attivi solo se ripiegati nella conformazione corretta (folding)

5 Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Folding ossidativo

6 Soltanto il corretto appaiamento di residui di cisteina porta alla conformazione biologicamente attiva

7 Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Glicosilazione

8 E. coli: nel citoplasma la formazione di ponti disolfuro è estremamente sfavorita Il citoplasma ha un potenziale redox molto basso (ambiente riducente) Il citoplasma ha un potenziale redox molto basso (ambiente riducente) Nel citoplasma non ci sono enzimi che sono in grado di ossidare i tioli (-SH) Nel citoplasma non ci sono enzimi che sono in grado di ossidare i tioli (-SH)

9 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) +

10 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)Chaperonine

11 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)Chaperonine

12 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)Chaperonine

13 Gene name Gene length SWISS- PROT Locatio n (kb) Description dnaJ1131P Chaperone with DnaK; DNA chain elongation; stress-related DNA biosynthesis, responsive to heat shock dnaK1917P HSP-70-type molecular chaperone, with DnaJ; stress-related heat-shock DNA biosynthesis, ATP- regulated binding and release of polypeptide substrates ecpD741P Possible pilin chaperone fimC726P Biosynthesis of fimbriae; periplasmic chaperone for type 1 fimbriae groL1647P Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL large subunit groS294P Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL small subunit htpG1875P Heat shock protein C62.5; chaperone ibpA414P Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family ibpB429P Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family narJ711P Nitrate reductase delta-subunit; chaperone secB468P Protein export; chaperone SecB tig1299P Trigger factor; chaperone

14 Mettersi in riga o venire eliminati: il ruolo delle chaperonine

15 Struttura del complesso GroEL/GroES (una della maggiori chaperonine citoplasmatiche) A) Veduta laterale B) Veduta apicale e basale

16 DnaK

17 Alto livello di espressione + errata conformazione Inclusion bodies

18 Vettori per lespressione di chaperonine

19 Il successo si consuma a freddo: i vettori per espressione a basse temperature

20 Inclusion bodies: se li conosci li eviti La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere meno riducente il citoplasma 3) cercando di rendere meno riducente il citoplasma 4) aumentando lespressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro 4) aumentando lespressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro

21 Inclusion bodies: se li conosci li eviti ma non necessariamente La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere un pò meno riducente il citoplasma 3) cercando di rendere un pò meno riducente il citoplasma 4) aumentando lespressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro 4) aumentando lespressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina dinteresse Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina dinteresse

22 Linvolucro dei batteri Gram negativi

23 Gram+ Laggiunta di peptidi segnale favoriscono il trasporto dal citoplasma allo spazio periplasmatico (es. MKTHRLNMTASLLIGISAFA ) La proteina periplasmatica DsbA induce la formazione di ponti disolfuro tra cisteine Lo spazio periplasmico è un ambiente ossidante

24 Espressione di proteine ricombinanti in Echerichia coli Vantaggi - Crescita rapida - Elevata densità cellulare su substrati poco costosi - Organismo molto ben caratterizzato e ricca collezione di mutanti - Numero elevato di vettori di clonaggio ed espressione Svantaggi Formazione di inclusion bodies Folding ossidativo limitato allo spazio periplasmico Modificazioni post- traduzionali non adeguate (ad es. glicosilazione)

25 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore despressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dellespressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi dinclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi dinclusione. Rinaturazione in vitro della proteina dinteresse

26 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore despressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dellespressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi dinclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi dinclusione. Rinaturazione in vitro della proteina dinteresse

27 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore despressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dellespressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi dinclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi dinclusione. Rinaturazione in vitro della proteina dinteresse

28 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore despressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dellespressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi dinclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi dinclusione. Rinaturazione in vitro della proteina dinteresse

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30 Rese di produzione Per cellula Per litro a 10 9 cells/ml Peso umido 9.5x g 0.95 g Peso secco 2.8x g 0.28 g Proteine totali 1.55x g 0.15 g Rese massime teoriche di una proteina dinteresse per litro di coltura a 10 9 cells/ml % delle proteine totali Resa/litro g mg mg

31 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore despressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dellespressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi dinclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi dinclusione. Rinaturazione in vitro della proteina dinteresse

32 Raccolta: filtrazione e centrifugazione Per lisare le cellule: lisozima sonicazione French Press French Press Nel caso di espressione periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock osmotico

33 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore despressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dellespressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi dinclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi dinclusione. Rinaturazione in vitro della proteina dinteresse

34 Fusioni traduzionali possono aiutare il processo di purificazione della proteina dinteresse attraverso cromatografia daffinità Peptidi o proteine che possiedono affinità per un particolare substrato possono essere fusialla proteina di interesse per facilitarne la purificazione Peptidi o proteine che possiedono affinità per un particolare substrato possono essere fusialla proteina di interesse per facilitarne la purificazione Possono essere fusioni con intere proteine (ad es. Maltose Binding Protein, Inteina, GST) Possono essere fusioni con intere proteine (ad es. Maltose Binding Protein, Inteina, GST) Oppure con piccoli epitopi (ad es. 6xHis, peptide FLAG) Oppure con piccoli epitopi (ad es. 6xHis, peptide FLAG)


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