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TRASFEZIONE GENICA CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008.

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Presentazione sul tema: "TRASFEZIONE GENICA CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008."— Transcript della presentazione:

1 TRASFEZIONE GENICA CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008

2 TRASFEZIONE GENICA Trasferimento di DNA esogeno in cellule di mammifero per lo studio della funzione e dei meccanismi di controllo dei GENI

3 Perché trasferire nelle cellule frammenti di DNA esogeno? IN RICERCAIN RICERCA: a) cellule in coltura –Identificazione di sequenze regolatorie –Struttura e funzione genica –Produzione di proteine Studio Farmaci b) IN VIVO: produzione di animali transgenici Modelli per la comprensione delle basi molecolari di malattie umane IN PRATICA CLINICAIN PRATICA CLINICA: TERAPIA GENICA –Ripristino di funzioni metaboliche deficitarie –Aumento delle difese naturali

4 Il trasferimento genico Tipi cellulari: Non tutte le cellule possono essere trasfettate con successo –Processo in sé inefficiente –Necessaria una fonte abbondante di cellule di partenza per ottenere un numero utilizzabile di cellule trasfettate –Linee cellulari immortalizzate - Crescita in medium chimicamente definito per tempo indefinito - Rapida duplicazione

5 Vettore –PLASMIDE –VIRUS (infezione) Promotore: –Corte sequenze nucleotidiche –Danno inizio alla trascrizione –Enhancer: elementi di regolazione positiva Derivati da virus –SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi cellulari –LTR: long terminal repeat »Raus Sarcoma Virus »CMV –Silencer: elementi di regolazione negativa Fattori per la replicazione: cis, trans ORI: sito di inizio della trascrizione (in genere SV40) MCS

6 TRANSIENTE: TRANSIENTE: - per esperimenti a breve termine (analisi ICC, studio del promotore…) - le cellule sono normalmente raccolte h dopo la trasfezione - over-espressione genica - popolazione cellulare disomogenea: poche cellule con molto plasmide - immediata STABILE: STABILE: - per esperimenti a lungo termine possibilità di isolare e propagare singoli cloni contenenti il DNA trasfettato - il plasmide si integra nel genoma, processo lungo e laborioso - lintegrazione è casuale - necessario marker di selezione (morfologia, resistenza a sostanze…) - popolazione cellulare omogenea: molte cellule con poco plasmide Che tipo di trasfezione?

7 1.Indagini sulla funzionalità di un gene PROMOTORE STD + GENE DINTERESSE 2.Controllo dellespressione genica: indagini sulla regolazione del promotore PROMOTORE DEL GENE DINTERESSE + GENE REPORTER Scopo della trasfezione

8 2. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless Promotore con inserzione + reporter Enhancer + Promotore + reporter Promotore deleto + reporter Promotore + reporter 1.Studio attività-funzione di una proteina - promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina

9 Mk di selezione: Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore –Creazione di linee stabili Reporter : Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche –Funzionalità di un promotore: reporter posto sotto il controllo di quel promotore –Funzionalità di un gene: Fusione del gene dinteresse con il gene reporter Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso promotore GENE REPORTER: GENE REPORTER: permette immediata identificazione delle cellule positivamente trasfettate

10 non deve avere unattività proteica SIMILE a quella del gene dinteresse lattività proteica del Reporter non deve INTERFERIRE con quelle fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri il saggio sullattività del reporter deve essere specifico, riproducibile e immediato Caratteristiche di un reporter

11 Cloramfenicolo acetil-transferasi:Cloramfenicolo acetil-transferasi: –Enzima batterico: resistenza allantibiotico cloramfenicolo –Acetilazione del Cloramfenicolo –Se si usa come substrato lantibiotico marcato con C14, viene acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che controlla lenzima è attivo. Si produce una miscela di molecole marcate rilevate su TLC o autoradiografia Esempio: ANALISI TLC IL Clone A non ha attività acetilasica I Cloni B e C hanno attività acetilasica clone Aclone B clone C geni reporter

12 ß-galattosidasi:ß-galattosidasi: –Codificato dal gene LacZ di E.coli –Conversione di alcune sostanze in composti colorati Citochimica: clivaggio del substrato XGal comparsa di precipitati BLU (colonie blu) Spettroscopia: clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-D- galactopyranoside ) composto solubile giallo Luciferasi:Luciferasi: luciferina + ATPluciferil adenilato + PPiATPPPi LUCE luciferil eadenilate + O2ossiluciferina + AMP + LUCEO2AMP geni reporter

13 Firefly Luciferase T-inducible luminescence ± T AR HSV TK promoter F Luc+ SV40 late poly(A) signal pPRE-TK-luc reporter plasmide PRE ori Amp r HSV TK promoter R Luc+ SV40 late poly(A) signal pRL-TKplasmide ori Amp r XX reagent Renilla Luciferase YY reagent inhibition constitutive luminescence Dual system -

14 GFP: green fluorescent proteinGFP: green fluorescent protein –espresso nella medusa Aequorea Victoria –in natura produce bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina) –lesposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza di colore verde in assenza di Ca, Aequorina o qualunque cofattore o substrato –mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che emettono luce a differente lunghezza donda CFP (cyan, colore blu) YFP (yellow, colore giallo) geni reporter

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16 RNApolII trascrive anche il sito di poliadenilazione, parte della porzione 3' viene rimossa e l'RNA poliadenilato. Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori di espressione degli eucarioti per avere la sintesi di mRNA Due elementi indispensabili per corretta POLIADENILAZIONE –sequenze ricche di GU o U downstream il sito di poliadenilazione; –sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate nucleotidi upstream il sito di poliadenilazione Sito di poliadenilazione

17 Clonaggio di un gene in un vettore

18 CARATTERISTICHE: –Elevata efficienza –Bassa tossicità –Riproducibilità in vitro e in vivo PROCESSO:PROCESSO: –Introduzione del DNA nella cellula –Ottenimento dellespressione del gene dinteresse –(selezione delle cellule che si sono trasfettate stabilmente) –Caratterizzazione del gene/ proteina prodotta PROBLEMATICHE:PROBLEMATICHE: –Come superare le barriere naturali??? DNA: fortemente POLARE (carica negativa) MEMBRANA CELLULARE LIPOFILA METODI DI TRASFEZIONE

19 1) METODI CHIMICI 2) METODI FISICI

20 CALCIO FOSFATO CALCIO FOSFATO Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule Gli ioni bivalenti possono promuovere lingresso di acidi nucleici attraverso le membrane. VANTAGGI Economico Relativamente versatile SVANTAGGI Tecnicamente delicato - forma e dimensioni del precipitato - influenzato da variazioni anche minime di pH Efficienza bassa Elevata Citotossicità Non funziona con alcuni tipi cellulari Metodi chimici

21 il primo metodo usato per lintroduzione di DNA nelle cellule eucariote DESTRANO: Polisaccaride costituito da unità di D-glucosio legate mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e di mediarne lingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono trattate con glicerolo o DMSO (shock osmotico) VANTAGGI Molto semplice SVANTAGGI Molto poco efficiente Solo transfezioni transienti DEAE-DESTRANO: DEAE-DESTRANO: Metodi chimici

22 misto di lipidi policationici e neutri, permette la formazione di vescicole liposomiali unilamellari che portano una carica netta positiva La testa cationica del composto lipidico si associa ai gruppi P negativi dellacido nucleico I complessi lipidi- DNA si fondono con le membrane cellulari e rilasciano spontaneamente il loro contenuto nelle cellule VANTAGGI: Bassa tossicità SVANTAGGI Difficile produrre liposomi Alta variabilità LIPOSOMI: LIPOSOMI: Metodi chimici

23 I lipidi cationici formano dei liposomi, con una superficie carica positivamente che consente lassociazione del DNA e media linterazione con la membrana plasmatica (carichi negativamente) Molecole formate da una coda policationica (DNA) e da una porzione lipidica (membrana) Esempio: LIPOFECTAMINA VANTAGGI Semplice Efficiente Poco tossico SVANTAGGI Condizionato dalla presenza di siero o antibiotici

24 Transferrina –Aggiunto al mix liposoma-DNA –Ligando che funziona da AGENTE DIREZIONANTE, grazie alla sua affinità con recettori di membrana, facilita linterazione e lingresso del complesso –Non specifico (come insulina…) Reazione cellulo-specifica: Ab-Ag Esempio: LIPOFECTAMINA reagenti e metodo

25 Un giorno prima : piastratura delle cellule –Devono arrivare a una confluenza del 50-80%: ottimizzazione della densità cellulare Trasfezione –Diluire il DNA in medium PRIVO di siero e antibiotici –Aggiungere la Transferrina (Tf) –Lasciare reagire 15 min –Diluire la Lipofectamina in D-MEM privo di siero –Aggiungere la Lipo al DNA+Tf –Lasciare reagire 15 min –Cambio medium: Eliminare dalle piastre il medium di crescita Aggiungere medium privo di siero e Ab (metà del volume) –Gocciolare il mix Lipo-DNA-Tf sulle cell –Lasciare reagire 3h –Rabboccare con D-MEM + siero (in proporzione doppia) + Ab Il giorno dopo: cambio medium e trattamenti

26 Le cellule vengono poste in una soluzione contenente DNA, e vengono esposte ad un breve impulso elettrico che produce transitoriamente dei pori nelle loro membrane VANTAGGI Può essere utile per quei tipi cellulari in cui non si ottengono risultati con i metodi classici Il DNA entra direttamente senza passare attraverso il compartimento endosomiale dove può aver luogo la degradazione dellacido nucleico SVANTAGGI Necessità di ottimizzare le condizioni del campo elettrico -intensità e durata- Elevato livello di tossicità (50%) ELETTROPORAZIONE: ELETTROPORAZIONE: Metodi fisici

27 il DNA viene inserito nella cellula -nel citoplasma o nel nucleo- attraverso un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione. Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di mm di diametro) la microiniezione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende: un microscopio, un micromanipolatore un iniettore VANTAGGI effettuare il trasferimento selettivamente nel citoplasma o nel nucleo aumenta efficienza di espressione modulare facilmente il livello di espressione SVANTAGGI Tecnicamente impegnativa Poche cellule alla volta COSTOSO MICROINIEZIONE: MICROINIEZIONE: Metodi fisici

28 Usa una pressione regolabile ad elio per sparare microcarriers doro rivestiti di DNA sulla parete interna di una cartuccia di plastica direttamente sul bersaglio Sistema per accelerare microproiettili doro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto VANTAGGI Possibilità di lavorare in situ Applicabile a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier per il trasferimento genico anche in vivo Possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni fisiologiche: espressione tessuto specifiche studi sullo sviluppo Possibilità di usare meno DNA e meno cellule di partenza SVANTAGGI Trattamento invasivo Efficienza fortemente dipendente dal tipo cellulare Molti parametri da controllare COSTOSO GENE GUN: GENE GUN: Metodi fisici

29 DNA da trasfettare –Privo di contaminanti: proteine/ RNA –Soluzione sterile TIPO DI CELLULE TIPO DI VETTORE –Adatto per aumentare lespressione in linee cellulari di mammifero TEMPO DI TRASFEZIONE –Da 30 min a 4 ore TIPO DI TERRENO DI COLTURA –Effetto di siero e antibiotici OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO

30 APPLICAZIONI SILENZIAMENTO GENICO SILENZIAMENTO GENICO SISTEMI INDUCIBILI SISTEMI INDUCIBILI

31 processo post-trascrizionale presente in molti organismi e tipi cellulari mediato da corte molecole di RNA (short interfering RNA o siRNA) provocano degradazione dellmRNA con sequenza complementare --> silenziamento gene-specifico scoperti altre forme di RNA silenziatori: microRNA esistono forme endogene e forme esogene endogeni: sintetizzate molecole di preRNAi da trascrizione di geni nucleari non-protein-coding-genes, servono per regolazione fine del pool proteico in ogni fase del ciclo cellulare e ruolo in funzioni biologiche (difesa antivirale, silenziamento dei centromeri, riarrangiamenti cromosomici e silenziamento trasposoni) esogeni: molecole potenzialmente dannose provenienti da fasi dinfezione virale o frammenti di RNA di sintesi chimica, iniettati nella cellula sfruttati in ricerca e come potenziali agenti terapeutici 1) RNA interference (RNAi):

32 Small interfering RNA (siRNA): silenziatori genici originano da molecole dsRNA più lunghe rascritte da geni codificanti per prodotti non proteici nel citoplasma dsRNA vengono riconosciuti da Dicer (complesso multienzimatico con attività RNAsi III simile) si originano frammenti di nt, i siRNA a doppio filamento siRNA-ds vengono inglobati in complesso ribonucleoproteico RISC (RNA-Induced Silencing Complex) attivato dallo svolgimento della doppia elica di siRNA RISC attivo riconosce mRNA con sequenza perfettamente complementare alla sequenza del siRNA legato degradazione mRNA e conseguente --> silenziamento sequenza-specifico

33 microRNA (miRNA): piccole molecole non codificanti di RNA RNA a singolo filamento di basi conservati durante levoluzione, identificati in diversi organismi tra cui uomo, nematodi, moscerino della frutta e piante originano da lungo dsRNA, processati da Dicer che utilizza precursori di basi a forma di forcina (hairpin) miRNA di basi vengono legati da un complesso simile a RISC specificità dappaiamento enzima-miRNA e mRNA target determina destino target: a) poco specifico: legame tra miRNA e target avviene al 5UTR del mRNA --> non si lega apparato traduzionale ma mRNA non viene degradato b) altamente specifico: mRNA viene degradato numero di geni target dei miRNA è maggiore di quello dei siRNA

34 STRATEGIE SPERIMENTALI: a differenza di quanto accade per le celule vegetali, in C. elegans e in Drosophila, nelle cellule animali lingresso di dsRNA di lunghezza maggiore di 30 nt può scatenare un processo di degradazione del filamento medesimo (meccanismo di difesa della cellula contro frammenti di genoma virale). quindi si utilizzano direttamente i siRNA (dsRNA di l<25nt) che vengono direttamente assemblati nel complesso RISC. siRNA possono essere: sintetizzati chimicamente trascritti in vitro e poi introdotti nella cellula mediante trasfezione iniettati in topi o inseriti in piante modificazione della tecnica: RNA interference DNA diretta (ddRNAi) APPLICAZIONI: controllo mirato e studio dellespressione genica: è infatti possibile spegnere geni specifici sia in colture cellulari che in modelli animali applicazioni anche nelle analisi di genomica funzionale applicazioni di tipo terapeutico: inibire oncogeni correlati a tumori prodotti in seguito a traslocazioni cromosomiche o mutazioni puntiformi. inibizione della replicazione virale in colture cellulari.

35 ddRNAi: permette uso di RNAi per silenziamento genico a scopo terapeutico e per lo screening di interi genomi si basa su: a) azione di promotori per lRNA pol III e per RNA pol II per lespressione di specifiche sequenze di siRNA trasfettate in cellule di mammifero permette di utilizzare DNA templati che permettono la sintesi di dsRNA corti in vivo, strutturalmente equivalenti ai siRNA attivi sintetizzati in vitro b) in alternativa si può usare uno short hairpin RNA (shRNA), cioè RNA costituito da sequenza omologa a mRNA da silenziare, un loop, ripetizione invertita della sequenza target

36 Protocollo per una trasfezione stabile: prima della trasfezione determinare la concentrazione a cui usare lagente selettivo è necessario trasfettare oltre al gene di nostro interesse anche il gene che conferisce la resistenza allagente selettivo trasfettare anche cellule, come controllo, senza il gene della resistenza per circa 14 gg cambiare il medium e aspettare che muoiano le cellule non trasfettate (non resistenti) o che non hanno integrato stabilmente il plasmide (che altrimenti viene perso dopo un certo numero di divisioni). Nella coltura di controllo le cellule devono morire quando si iniziano a vedere isole di cellule resistenti, trasferire i singoli cloni in MW96 e continuare con lo screening permettono di regolare lespressione di un gene richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare permettono di studiare lespressione di geni tossici: si possono ottenere linee cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene: - mantenuto spento in propagazione - acceso al momento dellesperimento 2) I sistemi inducibili

37 Geni per markers selettivi: Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide. timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina. Si selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In un terreno –timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide. - sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il nostro studio aminoglicoside fosfotransferasi (Neo): conferisce resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…). Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfettate necessario determinare la dose appropriata. igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza alligromicina (Hyg) asparagina sintetasi xantina-guanina fosforibosil transferasi

38 Lac system: Operone Lac: tre enzimi codificati dalla stessa unità trascrizionale - lacY permeasi necessaria per ingresso del lattosio nella cellula - lacZ beta-galactosidasi che converte lattosio in glucosio e galattosio - lacA tiogalattoside transacetilasi, non richiesta per metabolismo del lattosio Controllo da parte del repressore lac (gene lac I) separato dalloperone e sintetizzato in forma attiva; si lega sul promotore (operatore) e impedisce trascrizione dellintero operone. sistema di repressione batterico. scoperto negli anni50 allIstituto Pasteur di Parigi da F. Jacob e J. Monod, studiando leredità dei geni che controllano il metabolismo del glucosio e di altri zuccheri in E.coli. - lac lacI attivo blocco trascrizione Gli enzimi della via metabolica non sono sintetizzati se non richiesti + lac (o analogo IPTG) lacI viene inattivato trascrizione dellintero operone

39 Plasmide pGEX: - contiene proteina GST con a valle un sito di taglio per la trombina - regolato da promotore tac, promotore ottimizzato artificialmente, derivante dalla fusione del lac promoter operon con parte del promotore delloperone trp (triptofano ) - Mantiene inducibilità da IPTG, ma presenta livelli di espressione assai più alti rispetto al lac normale produzione di grosse quantità di proteina, purificabile mediante GST AD+polyQ ARGST LBDTrombine cleavage site Promotore lac

40 Chimera GST-AR TROMBINA: Taglio proteolitico Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser AR libero + GST legato MATRICE RESINA GLUTATIONE SEPHAROSE 4B Sfere di diametro µm Spaziatore di 12 atomi legato a glutatione (glicina, glutammato, cisteina)

41 Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox). Tet-On: laggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene Tet-Off: laggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline: Tet R= tet repressor protein: regola negativamente lespressione dei geni coinvolti nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla sequenza Tet O=tet operator e blocca la trascrizione. Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata: - tTA= Tc-controlled trans activator: proteina ibrida (37 kDa) ottenuta dalla fusione dei primi 207 aa di Tet R con 127 aa del C-ter dellactivator domain VP16 di herpes simplex virus diventa attivatore trascrizionale in presenza di Dox - rtTA= reverse tTA: proteina ottenuta modificando 4 aa di Tet R; ha comportamento opposto a tTA in risposta a Dox Tet system: TET-ON e TET-OFF

42 TET-ON rtTA TET-OFF tTA Il gene che vogliamo regolare deve essere inserito a valle di una sequenza TRE= Tc responsive elements, sequenze di 42 bp che contengono sequenza Tet O. Lespressione basale del promotore è molto bassa in assenza di Tc.

43 Tet-On vs Tet-Off: I due sistemi sono complementari. nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni circa 48 h per reprimere lespressione del gene X. il sistema Tet-On è responsivo solo alla Dox, mentre Tet-Off è sensibile a entrambi. le concentrazioni di Tc o Dox necessarie sono molto basse, inferiori a dosi citotossiche (sia per colture cellulari che per animali transgenici) in entrambi i casi sono necessarie due trasfezioni stabili consecutive: il plasmide regolatore e successivamente pTRE-gene X

44 1.piastrare cell e lasciarle crescere fino a circa 80% di confluenza 2.trasfezione con vettore pTet On/Off plasmide può essere linearizzato per aumentare efficienza di integrazione 3.permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e quindi aggiungere agente selezionante (G418, ug/ml) 4.cambio medium ogni 48 h o quando necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire 5.dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole colonie e trasferire ognuna in una well 6.screening: trasfezione con plasmide reporter, ex: pTRE-luc che contiene gene per la luciferasi di lucciola regolato da sequenza TRE 7.selezione delle colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto) 8.congelare stock dei cloni positivi 1^trasfezione stabile:

45 Trasfezione transiente preliminare: I cloni stabili positivi ottenuti nella 1^trasfezione vengono trasfettati in transiente con il plasmide pTRE-gene X per verificare leffettiva regolazione genica sul costrutto che si vole trasfettare stabilmente. Lanalisi della regolazione può essere effettuata con diverse tecniche: - Western Blot - RT-PCR -saggio funzionale per la proteina X - […]

46 1.piastrare cell stabili per pTet On/Off e lasciarle crescere fino a circa 80% di confluenza 2.Co-trasfezione con vettore pTRE-gene X e pTk-Hyg (10:1). I plasmid pòssono essere linearizzati per aumentare efficienza di integrazione 3.permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e quindi aggiungere agente selezionante (igromicina B, ug/ml) e Dox nel caso del sistema Tet-Off 4.cambio medium ogni 48 h o quando necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire 5.dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole colonie e trasferire ognuna in una well 6.screening: verificare espressione gene X, utilizzare la stessa tecnica usata nel controllo della trasfezione transiente 7.selezione delle colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto) 8.congelare stock dei cloni positivi 2^trasfezione stabile:

47 lo scopo è quello di generare una linea stabile che abbia un basso background e alti livelli di espressione della proteina X quando indotta (differenza di almeno 20 volte) livelli di espressione e induzione possono risentire del sito dintegrazione (ex: se integrazione avviene vicino a degli enhancer si può avere un aumento del livello di espressone basale). Per questo motivo è meglio screenare il maggior numero di colonie possibili per identificare quelle con le migliori caratteristiche se il plasmide pTRE non contiene un marker di selezione è necessaria co- trasfezione ad ex con plasmide pTk-Hyg. pTRE-gene X: pTk-Hyg 10/20:1 per aumentare probabilità che vengano acquisiti entrambi i vettori dalla cell e non solo quello della resistenza

48 esempio: NSC34-Tet Off


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