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IL LABORATORIO DI CHIMICA ORGANICA 1) Isolamento e Purificazione dei Composti Organici 2) Cromatografia.

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1 IL LABORATORIO DI CHIMICA ORGANICA 1) Isolamento e Purificazione dei Composti Organici 2) Cromatografia

2 LESTRAZIONE liquido-liquido Principi Generali Il principio che regola la distribuzione di una sostanza tra due solventi immiscibili è la legge di ripartizione o di distribuzione di Henry K = C B /C A K è il coefficiente di ripartizione o di distribuzione E se uso le solubilità: K = g B /g A x V A /V B Inoltre se: Va volume della soluzione da estrarre (fase di origine) g 0 massa in grammi del soluto Vs volume del solvente che si usa per lestrazione (fase estraente) g S massa del soluto che viene estratta C 0 concentrazione del soluto dopo estrazione nella fase di origine C SOLV concentrazione del soluto nella fase estraente Dalla relazione K = C SOLV /C 0 si ricava K = (g S /V S )/[ (g 0 -g S )/ Va] da cui: g S = g 0 (K Vs)/ (K Vs + Va) e se g 2 è la quantità che viene estratta con una seconda estrazione: g 2 = g S (K Vs)/ (K Vs + Va) = g 0 [(K Vs)/ (K Vs + Va)] 2 e per n estrazioni: g n = g 0 [(K Vs)/ (K Vs + Va)] n

3 g n = g 0 [(K Vs)/ (K Vs + Va)] n

4 ESTRAZIONE DISCONTINUA La scelta del solvente più adatto si basa su alcune considerazioni: ---- K deve essere il più alto possibile ---- Lestrazione deve essere selettiva ---- Il solvente deve essere facilmente allontanato ---- I due solventi devono avere densità diverse

5 ESTRAZIONE IN CONTINUO Estrattore per un solvente estraente a densità inferiore Estrattore per un solvente estraente a densità superiore Estrattore solido-liquido

6 PROBLEMI SPERIMENTALI NELLESECUZIONE DI ESTRAZIONI LIQUIDO-LIQUIDO Formazione di Emulsioni 1) Agitare con una bacchetta lentamente o far ruotare a vortice o centrifugare 2) Aumentare il volume di solvente estrattore 3) Aggiungere NaCl o una soluzione satura di Sali di Na o di ammonio 4) Filtrare la massa e senza agitare riversare nellimbuto 5) Far gorgogliare un gas o riscaldare delicatamente 6) Aggiungere alcune gocce di alcool

7 ESTRAZIONE DI COMPOSTI ORGANICI ACIDI E BASICI

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9 ESSICCANTI

10 CRISTALLIZZAZIONE

11 Il processo di cristallizzazione 1) scelta del solvente 2) solubilizzazione della sostanza da purificare nella minima quantità di un opportuno solvente (o miscela di solventi) ad una temperatura vicina al punto di ebollizione 3) filtrazione della soluzione calda per allontanare impurezze insolubili e polveri 4) raffreddamento del filtrato per permettere la cristallizzazione del prodotto principale 5) separazione dei cristalli mediante filtrazione 6) essiccamento dei cristalli 7) controllo del grado di purezza raggiunto

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15 DISTILLAZIONE

16 Evaporatore Rotante DISTILLAZIONE A PRESSIONE RIDOTTA

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18 Il coefficiente di distribuzione (K) è il rapporto tra la concentrazione di una sostanza in due fasi immiscibili: concentrazione nella fase stazionaria concentrazione nella fase mobile I composti da separare hanno coefficienti di distribuzione diversi nelle due fasi. K = Principi della separazione cromatografica CROMATOGRAFIA La cromatografia è una tecnica di analisi e/o separazione di sostanze in miscela basata sulla differente distribuzione delle speci da separare tra una fase mobile (liquido, gas o fluido supercritico) e una fase stazionaria immiscibile eventualmente posta su di un opportuno supporto

19 TIPI DI CROMATOGRAFIE Cromatografia su carta : la fase stazionaria liquida è legata alle fibre di cellulosa della carta. La fase mobile liquida sale, per capillarità, lungo la carta. Cromatografia su strato sottile (TLC) : la fase stazionaria, legata ad una matrice, è stratificata su vetro, plastica o metallo. La fase mobile liquida sale, per capillarità, sullo strato sottile. Cromatografia su colonna : la fase stazionaria, attaccata ad una matrice, è impaccata in una colonna di vetro. La fase liquida mobile viene fatta passare per gravità o sotto pressione attraverso la colonna.

20 Deposizione del campione su lastra per TLC CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

21 CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE Eluizione

22 Rf= A/S Fattore di Ritenzione

23 e) cromatografia di affinità in cui sulla fase stazionaria ci sono ligandi immobilizzati e si stabilisce un equilibrio tra una fase liquida mobile e il soluto che interagisce con queste molecole CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI

24 CROMATOGRAFIA SU COLONNA CROMATOGRAFIA DI ASSORBIMENTO

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27 Cromatografia su colonna CROMATOGRAFIA DI ASSORBIMENTO

28 Cromatografia su colonna CROMATOGRAFIA DI ASSORBIMENTO

29 CROMATOGRAFIA SU COLONNA A MEDIA-PRESSIONE

30 HPLC (high performance liquid chromatography

31 Schema di Cromatografia su colonna a media e alta pressione

32 Il sistema di pompe deve garantire una pressione in uscita di almeno 5 x 10 7 Pa, la capacità di flusso deve essere di almeno 10 ml/min per le separazioni preparative; non ci devono essere pulsazioni. Esistono 2 tipi di pompe: 1.pompe a pressione costante : funzionano mediante lintroduzione nella pompa di un gas sotto pressione che spinge leluente in colonna. Questo tipo di pompa dà un flusso senza pulsazioni, ma non è in grado di compensare uneventuale diminuzione della velocità di flusso dovuta a variazioni della permeabilità della colonna. 1.pompe a portata costante : sono in grado di mantenere sempre una velocità di flusso costante in colonna, ma danno piccole pulsazioni. In queste pompe un volume fisso di solvente viene spinto in colonna da un pistone.

33 La valvola di iniezione il campione può essere iniettato direttamente in colonna oppure attraverso un iniettore a spirale (loop). Liniezione può avvenire a flusso interrotto (a pressione atmosferica) oppure nel sistema sotto pressione. Spesso viene utilizzata una precolonna.

34 Le colonne per HPLC sono in acciaio inossidabile e sostengono una velocità di flusso di 2 ml/min.(analitiche) Le colonne preparative sopportano una velocità di flusso di 100 ml/min. Misurano 5-25 cm Hanno un diametro di 4.6 mm Le particelle hanno dimensioni di 3-10 m COLONNE PER HPLC

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37 Risoluzione R = 2[t R (B) - t R (A)] / [Wh(A) + Wh(B)] Capacità k = (t R – t M ) / t M Selettività a = kB / kA Efficienza N = 16(t R /Wb) 2 oppure n = 5.54(t R /Wh) 2

38 HEPT (Height Equivalent of a Theoretical Plate) = L/N L = lunghezza della fase stazionaria N = numero di piatti teorici Eq. di Van Deemter: HEPT = A + B/u + Cu A = diffusione microvorticosa B = diffusione molecolare longitudinale C = resistenza al trasferimento di massa u = velocità lineare media del gas/liquido di trasporto

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40 La cromatografia di ripartizione può essere di due tipi: 1.cromatografia liquida in fase normale : la fase stazionaria è più polare della fase mobile (che è un solvente organico); gli analiti vengono eluiti in ordine di polarità crescente. 2.cromatografia liquida in fase inversa : la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. La fase stazionaria è costituita da gruppi alchilsilanici legati chimicamente alla silice (butile, ottile, ottadecile). Come fase mobile si possono utilizzare solventi organici (metanolo, acetonitrile, tetraidrofurano), ma anche tamponi acquosi. Leluizione degli analiti avviene in ordine di polarità decrescente.

41 La separazione degli analiti dipende dalle interazioni con la fase stazionaria polare. Cromatografia liquida in fase normale

42 Nella RPC lidrofobicita, che dipende dalla polarita e dalle dimensioni dellanalita, e cio su cui si basa questo metodo di separazione. Maggiore è lidrofobicita di una molecola e piu a lungo rimarra sulla fase stazionaria. Cromatografia liquida in fase inversa

43 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO La separazione avviene sulla base della carica netta delle proteine (che dipende dal pK a della molecola e dal pH della soluzione). La fase stazionaria porta gruppi funzionali ionizzabili accoppiati ad una matrice inerte ( scambiatore ionico ). Queste cariche immobilizzate sono associate elettrostaticamente a controioni scambiabili della soluzione. Le molecole cariche da separare competono con i controioni per il legame ai gruppi carichi della fase stazionaria e vengono separate in base alla loro carica.

44 Cromatografia a scambio ionico

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48 scambiatori cationici (carichi negativamente) scambiatori anionici (carichi positivamente). Il meccanismo di scambio ionico avviene in 5 passaggi: 1. diffusione dello ione sulla superficie di scambio 2. diffusione dello ione allinterno della matrice fino al sito di scambio. E il passaggio limitante. 3. scambio degli ioni Scambiatore cationico : Scambiatore anionico : 4. diffusione dello ione scambiato sulla superficie 5. eluizione della molecola, mediante variazione del pH o della forza ionica RSO 3 - …Na NH 3 R RSO 3 - … NH 3 R + Na + R 4 N + …Cl OOCR + R 4 N… - OOCR + Cl -

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51 Gli scambiatori forti, sono totalmente ionizzabili a tutti i valori di pH: sulfonato -SO - 3 e lammonio quaternario -N + R 3 Gli scambiatori deboli sono ionizzabili solo ad un ristretto intervallo di pH: ione carbossilato - COO - e il dietilammonio -H + N(CH 2 CH 2 ) 2

52 SIZE EXCLUSION (gel permeation) CROMATOGRAPHY

53 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA La cromatografia di affinità non sfrutta delle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole, ma si basa su interazioni biologiche specifiche. La specificità di queste interazioni spesso coinvolge tipi diversi di legame. E il tipo di cromatografia più selettivo, può essere utilizzato come primo passaggio, per la purificazione sia di proteine che di acidi nucleici.

54 La matrice: destrano, agarosio, poliacrilamide La matrice ideale deve avere le seguenti caratteristiche: avere gruppi chimici adatti ed in numero sufficiente per il legame covalente con il ligando. essere stabile nelle condizioni di legame e nella successiva eluizione minimizzare ladsorbimento aspecifico avere buone proprietà di flusso.

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56 SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA SU CROMATOGRAFIA DI AFFINITA La matrice, accoppiata al ligando, viene impaccata in colonna. La colonna viene equilibrata. Dopo aver caricato il campione, la colonna viene lavata con il tampone di equilibramento, per rimuovere tutto ciò che non si è legato specificatamente. Si procede con leluizione

57 Non può essere troppo corto perché sarebbe ineffettivo Solitamente si usa un braccio spaziatore, fatto da 6-8 atomi di carbonio, che può essere idrofobico o idrofilico (gruppi metilenici, carbonilici, immidici) Non può essere troppo lungo perché potrebbe legare aspecificamente proteine Il braccio spaziatore deve possedere un secondo gruppo funzionale per il coupling al ligando Non è necessario per la purificazione di macromolecole, come le Ig

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59 LEluizione del composto di interesse può avvenire in modo specifico o non specifico: Leluizione aspecifica viene condotta variando il pH o la forza ionica. Leluizione specifica (per affinità) : facendo passare in colonna un composto che ha unaffinità per la molecola di interesse maggiore di quella del ligando. Leluizione

60 Gas Cromatografia


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