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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 8 BIOFARMACI E PROTEINE TERAPEUTICHE: PROBLEMATICHE LEGATE ALLA LORO FARMACOCINETICA/DINAMICA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA.

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1 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 8 BIOFARMACI E PROTEINE TERAPEUTICHE: PROBLEMATICHE LEGATE ALLA LORO FARMACOCINETICA/DINAMICA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi

2 PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE INSULINA FATTORI DI CRESCITA DELLEMATOPOIESI INTERLEUCHINE ED INTERFERONI ORMONE DELLA CRESCITA ENZIMI (ANTICORPI MONOCLONALI) (VACCINI) FATTORI DELLA COAGULAZIONE

3 NOME COMMERCIALE PROTEINA TERAPEUTICA AZIENDA FARMACEUTICA PRINCIPALE INDICAZIONE TERAPEUTICA IN USA ANNO HUMULININSULINA UMANAELI LILLYDIABETE1982 PROTROPINORMONE SOMATOTROPOGENENTECHDEFICIENZA GH1985 INTRON AINTERFERONE ALFA 2b SHERING-PLOUGHLEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE 1986 ROFERON AINTERFERONE ALFA 2a HOFFMANN- LA ROCHE LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE 1986 HUMATROPEORMONE SOMATOTROPOELI LILLYDEFICIENZA GH1987 ACTIVASETPAGENENTECHINFARTO CARDIACO1987 EPOGENERITROPOIETINAAMGENANEMIA RENALE1989 ALFERON NINTERFERONE ALFA N3 INTERFERON SCIENCES PORRI GENITALI 1989 NEUPOGENG-CSFAMGENNEUTROPENIA DA CHEMIOTERAPIA 1991 PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE

4 NOME COMMERCIALE PROTEINA TERAPEUTICA AZIENDA FARMACEUTICA PRINCIPALE INDICAZIONE TERAPEUTICA IN USA ANNO LEUKINEGM-CSFIMMUNEXTRAPIANTO MIDOLLO AUTOLOGO 1991 PROLEUKINIL-2CHIRONCARCINOMA RENALE 1992 RECOMBINATEFATTORE ANTIEMOFILIA GENETIC INSTITUTE EMOFILIA A1992 KOGENATEFATTORE VIIIMILESEMOFILIA A1993 BETASERONINTERFERONE BETA 1-B CHIRONSCLEROSI MULTIPLA1993 PULMOZYMEDNasiGENENTECHFIBROSI CISTICA1993 NUTROPINGHGENENTECHDEFICIENZA CRESCITA DA INSUFFICIENZA RENALE 1994 CEREZYMEGLUCOCEREBROSIDASIGENZYMEMALATTIA DI GAUCHER1994 GONAL-FFSHSERONOINFERTILITA1996 PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE

5 2000EMOFILIA AGENETICS INSTITUTE FATTORE VIIIREFACTO 1999EMOFILIA A e BNOVO NORDISK FATTORE VIIaNOVOSEVEN 1997EPATITE CAMGENINTERFERONE ALFACON-1 INFERGEN 1997EMOFILIA BGENETICS INSTITUTE FATTORE IXBENEFIX 1996SCLEROSI MULTIPLA BIOGENINTERFERONE BETA 1a AVONEX 2000OSTEOPETROSIINTERMUNEINTERFERONE GAMMA 1b ACTIMMUNE ANNOPRINCIPALE INDICAZIONE TERAPEUTICA IN USA AZIENDA FARMACEUTICA PROTEINA TERAPEUTICA NOME COMMERCIALE PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE

6 Le proteine terapeutiche oggi disponibili sono utilizzabili nella terapia di patologie quali: Neoplasie (interferoni, anticorpi monoclonali Patologie cardiovascolari, fibrosi cistica, morbo di Gaucher (Enzimi, fattori ematici) Diabete (Insulina) Anemia (Eritropoietina) Emofilia (fattori ematici di coagulazione) Le terapie con proteine terapeutiche di maggiore utilizzo nel 2003 sono state: Johnson & Johnson Procrit trattamento per anemie Amgen Epogen trattamento anemia Schering-Plough: Intron A and Peg-Intron per il trattamento dellepatite Oggi le classi terapeutiche più utilizzate sono: Eritropoietina Anticorpi monoclonali Interferoni

7 FARMACOCINETICA E FARMACODINAMICA FARMACO LEGATO A PROTEINA CONCENTRAZIONE PLASMATICA FARMACO LEGATO A TESSUTO CONCENTRAZIONE TISSUTALE DOSE ASSORBIMENTO DISTRIBUZIONE FARMACO NEL COMPARTIMENTO DI EFFETTO FARMACO LEGATO A RECETTORE/EFFETTORE EVENTI POST- RECETTORIALI EFFETTO BIOCHIMICO RISPOSTA FARMACOLOGICA METABOLISMO ED ESCREZIONE ELIMINAZIONE

8 ASPETTI FARMACOCINETCI E FARMACODINAMICI DI FARMACI PROTEICI O PEPTIDICI LA FARMACOCINETICA STUDIA LA CINETICA DEI PROCESSI RESPONSABILI DELLA VARIAZIONE TEMPORALE DEI LIVELLI DEI COMPOSTI ESOGENI NELLORGANISMO IMPORTANZA DELLA RELAZIONE TRA ASPETTI FARMACOCINETICI E FARMACODINAMICI NELLAZIONE DI UN FARMACO I PROCESSI SONO: ASSORBIMENTO DISTRIBUZIONE METABOLISMO ESCREZIONE

9 1)VIA ORALE 2)VIA PARENTERALE 3) VIE ALTERNATIVE ENDOVENOSA INTRAMUSCOLARE SOTTOCUTANEA INTRAPERITONEALE TRANSNASALE BUCCALE RETTALE TRANSDERMICA POLMONARE SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

10 VIA ORALE controindicata a causa di: A. ELEVATA DEGRADAZIONE B. SCARSO ASSORBIMENTO Endopeptidasi presenti a livello intestinale (pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi) Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B) Molecole di grande dimensioni Assenza di meccanismi di trasporto attivo

11 ECCEZIONE: VACCINI ORALI le cui cellule bersaglio sono linfociti e antigen presenting cells (APC) presenti nelle PLACCHE DEL PAYER villi FOLLICOLO LINFOIDE: gruppo di cellule contenenti le cellule M disperse in cellule epiteliali centro germinale (area delle cellule B) cellule epiteliali lume intestinale parete intestinale cellule M

12 VIA PARENTERALE via delezione: La scelta della via endovenosa,intramuscolare, sottocutanea e intraperitoneale dipende dallemivita della proteina stessa e dalla concentrazione ematica necessaria per ottenere leffetto farmacologico Es: lemivita del TPA è di pochi minuti, mentre quella di un anticorpo monoclonale è di alcuni giorni SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

13 si può passare dalla somministrazione per via i.v. a quella i.m. o s.c. tenendo conto che: 1. La prolungata residenza nel sito diniezione aumenta lesposizione a reazioni di degradazione (es.insulino-resistenza di diabetici dovuta ad alte concentrazioni di peptidasi tissutali) 2. Dopo iniezione s.c. il farmaco può entrare nei capillari linfatici e non utilizzare il torrente circolatorio dando una differente biodisponibilità si possono operare modificazioni nella proteina (mutagenesi) SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE PER AUMENTARE LEMIVITA

14 VIE ALTERNATIVE: POLMONARE TRANSDERMICA TRANSNASALE Nel caso di una azione sistemica queste vie hanno limitata rilevanza, mentre possono essere valide qualora sia richiesta una azione locale. IMPORTANZA VIA NASALE IMPORTANZA VIA NASALE SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

15 ASSORBIMENTO DI PROTEINE TERAPEUTICHE Aumento permeabilità delle barriere dassorbimento (attraverso iontoforesi, uso liposomi, aggiunta di acidi grassi/fosfolipidi,acidi biliari, enamine derivate dalla fenilglicina, detergenti, derivati salicilici, ciclodestrine) Diminuzione attività peptidasica nel sito di assorbimento (attraverso luso di inibitori di proteasi) Aumento della resistenza contro la degradazione (attraverso modificazioni della struttura molecolare) Aumento tempo desposizione (con PEG-polietilenglicol) APPROCCI PER AUMENTARE ASSORBIMENTO

16 Approcci per il controllo della velocità di somministrazione SISTEMI APERTI: POMPE MECCANICHE POMPE OSMOTICHE SISTEMI CHIUSI : COMBINAZIONI POMPE BIOSENSORI SISTEMI AUTOCALIBRANTI CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE

17 SOMMINISTRAZIONE PULSATILE INFUSIONE CONTINUA TEMPI FLESSIBILI Problemi: 1. Controllo del flusso (erogazione corrente,flusso nellago, perdita liquido dal catetere…) 2. Stabilità del farmaco a lungo termine (il farmaco deve essere stabile a t°ambiente e a 37 C°) 3. Anche con le pompe più sofisticate è necessario raccogliere dati per aggiustare il flusso (questo implica la raccolta invasiva di fluidi corporei) POMPE MECCANICHE

18 Problemi: 1.Controllo del flusso (la velocità di rilascio è costante, condizione non sempre desiderabile) 2.Stabilità del farmaco (la dispersione/soluzione di proteina deve essere stabile alla temperatura corporea) POMPE OSMOTICHE MEMBRANA SEMIPERMEABILE (DOVE ENTRA ACQUA) RESERVOIR AGENTE OSMOTICO MEMBRANA IMPERMEABILE DEL RESERVOIR MODERATORE DEL FLUSSO CAPPUCCIO RIMUOVIBILE SOLUZIONE DI FARMACO USCENTE ESEMPIO DI MINIPOMPA OSMOTICA IMPIANTABILE SOTTOCUTANEA

19 Problemi: 1. Non sempre esiste una correlazione fra livelli plasmatici di proteina ed effetto terapeutico 2. Non è ancora possibile disegnare biosensori che lavorino in vivo per periodi prolungati 3. Il biosensore deve essere stabile, robusto e non dare reazioni istologiche COMBINAZIONE POMPE-BIOSENSORI SENSORE PROGRAMMA SORGENTE DENERGIA FARMACO SISTEMA CONTROLLO DEL RILASCIO FLUSSO CONTROLLATO EFFETTO TERAPEUTICO CONCENTRAZIONE DI FARMACO DESIDERATA NEL SITO TARGET APERTURA DEL RILASCIO SISTEMA TERAPEUTICO BIOSISTEMA SEGNALE NEGATIVO DI FEEDBACK

20 REAZIONI ENZIMA SUBSTRATO Sono basati sul cambiamento di pH quando il glucosio viene convertito in ac.gluconico. Il pH induce cambiamenti nei polimeri acido- sensitivi che iniziano così a rilasciare insulina. SISTEMI AUTOCALIBRANTI il rilascio della proteina viene controllato da uno stimolo corporeo attraverso diverse strategie concavalinaA beads di sefarosio COMPETITIVE DESORPTION GLUCOSIO INSULINA

21 E preferibile luso di una membrana che escluda le componenti umorali e cellulari del sistema immunitario per permettere alla cellule di vivere senza lausilio di agenti immunosuppressivi CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE CELLULE PRODOTTI DI SECREZIONE NUTRIENTI PORI DELLA MEMBRANA

22 SOMMINISTRAZIONE SITO-SPECIFICA ANTICORPI MONOCLONALI UMANIZZATI ANTICORPI BISPECIFICI ANTICORPI CONIUGATI CON COMPOSTI ATTIVI LIPOSOMI

23 BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI A CAUSA DELLE GRANDI DIMENSIONI DI UNA PROTEINA IL VOLUME APPARENTE DI DITRIBUZIONE E DI SOLITO RELATIVAMENTE PICCOLO VOLUME INIZIALE DOPO I.V. = VOLUME TOTALE DEL PLASMA VOLUME TOTALE DI DISTRIBUZIONE VOLUME INIZIALE DI DISTRIBUZIONE E IL DOPPIO O MENO DEL DOPPIO DEL O APPENA MAGGIORE

24 A differenza dei farmaci sintetici, per i quali lo studio della biodistribuzione è necessario per evitare laccumulo di metaboliti tossici in particolari tessuti, la biodistribuzione di proteine terapeutiche indica solo lavvenuta distribuzione del farmaco in un particolare tessuto, dato che gli aminoacidi della proteina possono essere riutilizzati BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI La misurazione della biodistribuzione viene effettuata con farmaci marcati (presenza di tirosine e lisine) La difficoltà nelleseguire studi di biodistribuzione impone di utilizzare lintensità e la durata delleffetto farmacologico come prova e misura dei livelli di un farmaco in un particolare tessuto

25 BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI SANGUE DRUG LINFA SITO DINIEZIONE FARMACO A BASSO P.M. FARMACO AD ALTO P.M. La biodistribuzione nei vasi linfatici dopo iniezione s.c. rappresenta lunico meccanismo di trasporto per macromolecole, che raggiungono il torrente circolatorio indirettamente attraverso il sistema linfatico: composti con P.M. maggiore di 16kD vengono assorbiti dai vasi linfatici, mentre i composti inferiori a 1kD non vi penetrano quasi per nulla

26 ELIMINAZIONE DI FARMACI PROTEICI 1. PROTEOLISI 2. ESCREZIONE E METABOLISMO RENALE 3. METABOLISMO EPATICO 4. ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA AD OPERA DI ALTRE CELLULE

27 ELIMINAZIONE RENALE DI PROTEINE aminoacidi Tubulo Prossimale Filtrato Glomerulare Lume Angiotensina Bradichinina Tubulo Distale Vaso Peritubulare IL-2 Insulina Calcitonina Ormone paratiroideo vasopressina Recettore Lisosomi Non mediato Proteine Glomerulo Solo per piccole proteine (P.M. 20nm) La clearance renale è più alta per molecole caricate positivamente rispetto a quelle caricate negativamente Dopo la filtrazione glomerulare le proteine possono essere riassorbite dal tubulo prossimale tramite endocitosi e,una volta idrolizzate nelle cellule ad amminoacidi, ritornare nel circolo sistemico. proteine

28 METABOLISMO EPATICO Diffusione passiva ( solo per piccole proteine molto idrofobiche quali ciclosporina e peptidi ciclici) Trasporto energia- dipendente (per peptidi di dimensioni più elevate) Endocitosi mediata da recettore (per insulina ed EGF) Recettori che legano gli zuccheri (per glicoproteine) Proteine correlate al recettore per LDL- LRP (per t-PA, u-PA, trombospondina)

29 METABOLISMO EPATICO La velocità di eliminazione intra-epatocita dipende dalla sequenza proteica e dalla presenza di siti di riconoscimento di endopeptidasi Proteine a vita media elevata sono degradate in lisosomi Gli oligopeptidi risultanti dallattacco di endopeptidasi sono ulteriormente degradati da esopeptidasi e poi rientrano nel pool metabolico cellulare

30 ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA AD OPERA DI ALTRE CELLULE M-CFS viene eliminato dai reni quando è presente in elevate quantità: a concentrazioni minori viene captato dai macrofagi con un meccanismo recettore mediato saturabile G-CSF e un suo derivato (nartograstima) sono captati dal midollo osseo attraverso un processo saturabile recettore mediato

31 PROTEINE DI LEGAME PLASMATICHE Riportate per IGF-I, IGF-II, t-PA, GH, Dnase,NGF… Il legame di proteine terapeutiche a proteine circolanti nel plasma rende particolarmente complesse le cinetiche di distribuzione ed eliminazione

32 ASPETTI FARMACODINAMICI DI FARMACI PROTEICI La costruzione di curve DOSE-RISPOSTA è particolarmente utile nella sperimentazione di fase II dato che aiuta a scegliere la dose ottimale per la fase III Si ritiene che i farmaci biotecnologici manifestino talora una curva dose-risposta a campana

33 SCALING INTERSPECIE Le tecniche per la predizione di parametri farmacocinetici in una specie da dati derivanti da una specie diversa usando equazioni allometriche permettono di stimare il range di dosi da studiare, anche se non possono sostituire gli studi stessi. P= a.W b P: parametro farmacocinetico W: peso corporeo a: coefficiente allometrico b: esponente allometrico

34 IMMUNOGENICITA LA FORMAZIONE DI ANTICORPI AVVIENE IN GENERE DOPO SOMMINISTRAZIONE CRONICA DI PROTEINE TERAPEUTICHE Gli anticorpi possono neutralizzare lattività biologica della proteina e possono modificarne la farmacocinetica e farmacodinamica La risposta immunitaria viene di solito indotta quando la proteina è estranea allospite: inoltre le iniezioni extravascolari stimolano maggiormente la produzione di anticorpi rispetto alla somministrazione per endovena

35 FORMULAZIONE DI PROTEINE/PEPTIDI TERAPEUTICI 2.DECONTAMINAZIONE VIRALE : analisi dei m.o. e cellule deputate alla produzione. Rischio nellutilizzo di eccipienti derivati ematici (albumina) 1.STERILITA: la produzione deve essere fatta in condizioni di sterilità per limpossibilità di utilizzare sistemi di sterilizzazione quali radiazioni ionizzanti, gas e calore

36 fosfato Acido grasso lipideA core catena antigenica lipopolisaccaride zucchero n STRUTTURA DI UNA ENDOTOSSINA 3. RIMOZIONE PIROGENI : generalmente derivanti da batteri, funghi, virus che contaminano la preparazione (endotossine da Gram negativi quali LPS). In genere sono caratterizzati da carica negativa elevata. Stabili in condizioni standard di sterilizzazione in autoclave, vengono distrutti in presenza di temperature elevate a secco (>250° per 30 min.)

37 ECCIPIENTI USATI NELLA FORMULAZIONE DI PRODOTTI BIOTECNOLOGICI 1)AGENTI SOLUBILIZZANTI 2)AGENTI ANTIAGGREGANTI 3)AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH 4)CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI 5)AGENTI OSMOTICI 6)TAMPONI 7)CARRIERS

38 AGENTI ANTIAGGREGANTI Sono necessari per ridurre lassorbimento della proteina terapeutica alle superfici della fiala, siringa, ago…. Es.assorbimento insulina su superficie idrofobica CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI Per il blocco dellossidazione di metionina, cisteina, triptofano, tirosina e istidina in genere lossigeno viene sostituito con un gas inerte o tramite laggiunta di ascorbato. Superficie idrofobica cristalli monomeri aggregati insolubili

39 AGENTI OSMOTICI Si tratta di soluzioni saline e di mono/disaccaridi. Possono influenzare la termostabilità della proteina. AGENTI SOLUBILIZZANTI Bloccano laggregazione di proteine, soprattutto non glicosilate e ne evitano la precipitazione limitando interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche. Il pH ha notevole importanza nel mantenimento del prodotto in soluzione: laggiunta di aminoacidi come lisina o arginina o di surfattanti come sodiododecilfosfato possono aumentare la solubilità. Es.Effetto della concentrazione di arginina sulla solubilità del TPA ARGININA-FOSFATO SOLUBILITA

40 AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH pH hGH mg/ml Es. Solubilità del GH in funzione della variazione di pH Tamponi usati per la formulazione di prodotti biotecnologici sono di solito fosfato, acetato, citrato 4 5

41 CONSERVAZIONE DELLE PROTEINE TERAPEUTICHE SOLUZIONE ACQUOSA FORME LIOFILIZZATE TAVOLETTE

42 BIBLIOGRAFIA Wierda et al.Immunogenicity of biopharmaceuticals in laboratory animals, Toxicology,(158)71-74,2001 Bickel et al.Delivery of peptides and proteins through the blood-brain barrier,Advanced Drug Delivery Reviews,(46)247-79,2001 Stoll et al.A mechanistic analysis of carried-mediated oral delivery of protein therapeutics,Journal of Controlled Release,(64)217-28,2000 Stayton et al.Molecular engineering of proteins and polymers for targeting and intracellular delivery of therapeutics, Journal of Controlled Release,(65) ,2000 Yang et al.Effect of zinc binding and precipitation on structures of recombinant human GH and NGF,Journal of Pharmaceutical Sciences, (89)1480-5,2000 Witschi et al.In vitro evaluation of microparticles and polymer gels for use as nasal platforms for protein delivery,Pharmaceuticals Research,(16) ,1999


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