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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE n° 5 siRNA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2008-09 Adriana Maggi.

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1 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE n° 5 siRNA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA Adriana Maggi

2 Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI Duplicazione DNA duplicato DNA RNA Trascrizione Maturazione Metabolismo Traduzione PROTEINA FARMACI TRADIZIONALI

3 ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI 1.ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con lm-RNA 2.ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA 3.RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA 4.APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza aminoacidica (competono con lRNA nella interazione tra RNA e proteina) 5.DECOY:DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono con sequenze di DNA nellinterazione DNA- proteina) 6.siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

4 RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con lespressione genica: sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione

5 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. FireCraig C. Mello Stanford University University of Massachusetts b b In 1998 Fire and Mello described the presence of si RNA in C.elegans Nel 2001 Tuschl et al. dimostrano che una piccola sequnza di RNA puo interferire in modo specifico con la trascrizione

6 Interferenza basata su RNA (RNA interference) Attori: Micro RNA (miRNA) precursori a forcina Ribonucleasi DICER Small interfering RNA (Si) (2 nt 3 protrundenti) RISC RNA RNA driven interference silencing complex che comrende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso 8° nt risptto al terminale 5.

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8 Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo avvenire diverse volte in quanto lRNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo agire per 3-7 giorni.

9 Risc unwinds dsRNA, the ribonuclease in the Ribonuclese complex hydrolizes new targets

10 Nature Reviews Genetics 2007, 8:884 LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA

11 RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)

12 RNA interference-mediated heterochromatin assembly siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group. Marjori A. Matzke & James A. Birchler Nature Reviews Genetics 6, (January 2005

13 Attività di siRNA a livello del nucleo Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali) Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazioe di eterocromatina) Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)

14 siRNA sintetico a doppio filamento shRNA plasmidico RNA lungo a doppio filamento miRNA endogeno NT funzione miRNA Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex) Complesso RISC attivato Blocco traduzione funzione siRNA Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi

15 si RNA – caratteristiche RNA a doppia elica di nt Presenza di terminale 3 più lungo di 2nt Presenza di gruppi OH in 3 Presenza 5 fosfato Alta stabilità nella porzione 5 senso(ricco in GC) Bassa stabilità nella porzione 5 antisenso(ricco UA) Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire lattacco della endonucleasi 2 desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche Non deve essere complementare a zone introniche Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

16 si RNA – caratteristiche

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19 In rosso: siRNA marcato In blu: nuclei In verde la proteina GAPDH CELLULE HELA si RNA non specificosi RNA contro GAPDH Trattamento: 48h

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21 siRNA come agenti terapeutici LA DISTRIBUZIONE Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari Degradabilità dovuta a Rnasi circolanti (RNA naturale puo essere utlizzato in cervello e polmoni) Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)

22 siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE

23 siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE 1.Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale 2.Somministrazione sistemica: a.iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier) b.RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica c.Utilizzo di vettori virali e non per esprimere lRNA a della cellula bersaglio

24 siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2-o- metile nel filamento antisenso) fosforotionati per bloccare esonucleasi coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG

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29 BIODISTRIBUZIONE

30 Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*, Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin, Gregory J. Hannon, Mark A. Kay* Nature, 2002

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34 siRNA IN STUDI CLINICI

35 Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso Similarità: - lunghezza - metodologia di delivery comune - induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale - digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi - possibilità di stabilizzzione con basi modificate - similarità nella biodistribuzione Differenze:- doppio filamento verso singolo filamento - maggiore stabilità della molecola naturale - maggiore efficacia in cellule in coltura - meccanismo di azione mediato da RISC

36 Riferimenti bibliografici Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884 Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556 Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic adminitrtion. Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142 Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery Nature Reviews Drug Discovery 8, (February 2009)Knocking down barriers: advances in siRNA delivery


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