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Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.

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Presentazione sul tema: "Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010."— Transcript della presentazione:

1 Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010

2 Cosa sono Come si producono Microarray e Tiling Arrays Quali utilizzi hanno Chip a DNA

3 I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 10 7 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso Cosa sono i chip a DNA

4 I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 10 7 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso Cosa sono i chip a DNA

5 I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 10 7 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso Cosa sono i chip a DNA

6 FOTOLITOGRAFIA (in situ): Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto; SPOTTED MICROARRAYS: Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sullarray, e solo successivamente spottati sul supporto. Come si producono

7 Microarray e Tiling array MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti Gene 1Gene 2 TILING ARRAYS: coprono lintero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…) Gene 1Gene 2

8 Quali utilizzi hanno MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per lanalisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.) Gene 1Gene 2 TILING ARRAYS: Utilizzati per analisi unbiased dellespressione genica (geni non noti e miRNA); ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip) Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per lindividuazione di copy number variations e anomalie del DNA Gene 1Gene 2

9 da dove siamo partiti dove volevamo arrivare quali tecnologie abbiamo usato I gruppi sperimentali Il mio esperimento

10 Gli estrogeni sono i principali ormoni sessuali nella donna ed influenzano la fisiologia femminile sotto vari aspetti Gli estrogeni permeano nelle cellule e legano il loro specifico recettore, una proteina intracellulare che, una volta attivata, è in grado di dimerizzare e attivare la trascrizione di specifici geni Da dove siamo partiti

11 Il modello animale utilizzato nel nostro laboratorio per lo studio dellattivazione del recettore degli estrogeni in vivo è il modello ERE-Luc Da dove siamo partiti

12 Con questo modello abbiamo osservato lattività del recettore degli estrogeni in condizioni fisiologiche nellanimale femmina ciclante, e ci siamo focalizzati sullo studio del ruolo del recettore degli estrogeni nel fegato Da dove siamo partiti

13 dove volevamo arrivare Femmine adulte ciclanti Gravide > 22 mesi (menopausa) Prepuberi

14 quali tecnologie abbiamo usato Tiling Arrays Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni Dove si localizza ERalfa? La sua localizzazione è influenzata dagli estrogeni circolanti? Microarray di espressione Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni I livelli di estrogeni circolanti influenzano lespressione genica? Quali sono i geni differenzialmente espressi?

15 I gruppi sperimentali METESTRO Bassi livelli di estrogeno circolante PROESTRO Alti livelli di estrogeno circolante

16 Workflow Output Analisi dei Dati Risultati Microarray

17 Workflow Congelamento Estrazione RNA Retrotrascrizione Microarrays Marcatura Ibridazione

18 Output Quasi trascritti conosciuti

19 Output I dati grezzi vengono raccolti in un file: File CEL E normalizzati: file RMA … e analizzati grazie allaiuto del team di bioinformatici

20 Output Met > Pro Met < Pro Met Pro Livello E2 Lista dei geni individuati

21 Analisi dei dati Come otteniamo informazioni da questa lista di geni? Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY

22 GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise. E suddiviso in 3 categorie: Processi biologici Funzioni molecolari Componenti cellulari Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari. Analisi dei dati

23 Risultati Met > Pro Met < Pro REGOLAZIONE della TRASCRIZIONE dellmRNA (pVal=4.80 e-2) I L M BIOSINTESI DEI LIPIDI e COLESTEROLO (pVal=5.10 e-6) A B C D E F DETOXIFICATION (pVal=1.20 e-4) G H 16%

24 Risultati Ciclo Krebs B X J C D …. TG Biosintesi degli acidi grassi Biosintesi del colesterolo Z W Y E F

25 Workflow e messa a punto Output Analisi dei dati Risultati ChiP On chip

26 Workflow e messa a punto Sonicazione ChIP-chip Crosslinking Immunopre-cipitazione Y Crosslinking inversoPurificazione DNA LM-AmplificationFrammentazione MarcaturaIbridazione

27 Output Cutoff 1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA 2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo 3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff

28 Output Chr BED file

29 Analisi dei dati Analizzandoli uno ad uno…. … chiedendo laiuto dei bioinformatici che hanno creato di sicuro qualche software che ti sarà daiuto

30 Analisi dei dati Chr 10 > > Dove si localizzano (cromosomi) Dove si localizzano rispetto a geni noti Quali sequenze legano Quali sono i geni che si trovano nelle vicinanze?

31 Risultati 553 siti di binding 444 siti di binding 15%

32 Risultati 18% 51% 27% 12% 58% 28% Proestro Metestro Geni che presentano un sito di binding a METESTRO nellintorno di 20kb Metabolismo dei lipidi e del colesterolo (pVal=1.30 e-3) Reagolazione dellattività riproduttiva (pVal=1.40 e-3) Geni che presentano un sito di binding a PROESTRO nellintorno di 20kb Regolazione dellespressione genica (pVal=8.50 e-5) Regolazione dellattività riproduttiva (pVal=3.90 e-4)

33 Significato biologico Real time PCR Esperimenti sullanimale Come vengono utilizzati i dati ottenuti nei due esperimenti?

34 Real Time PCR Fatty acid biosynthetic pathway Cholesterol biosynthetic pathway I geni epatici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e del colesterolo mostrano un andamento regolare durante il ciclo regolato dalla fluttuazione di estrogeni circolanti

35 Real Time PCR I geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna

36 Successivi esperimenti sullanimale Femmine adulte ciclanti Gravide > 22 mesi (menopausa) Prepuberi Il livello di espressione dei geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna Si modifica anche il contenuto di lipidi del sangue e del fegato? Qual è la conseguenza biologica? Come può essere ripristinato il profilo lipidico corretto?

37 Grazie dell attenzione


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