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Le malattie da triplette 28 Aprile 2010 Paola Rusmini.

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Presentazione sul tema: "Le malattie da triplette 28 Aprile 2010 Paola Rusmini."— Transcript della presentazione:

1 Le malattie da triplette 28 Aprile 2010 Paola Rusmini

2 Una porzione significante del genoma umano contiene semplici sequenze ripetute come i MICROSATELLITI. I Microsatelliti sono : -Sequenze ripetute in TANDEM di 1-6 nucleotidi. -Templato per mutazioni dinamiche trovate in diverse malattie denominate MALATTIE da TRIPLETTE (malattie neurologiche).

3 Le mutazioni dinamiche: -sono cambiamenti nel materiale genetico che possono continuare a mutare nei tessuti (mitosi) e lungo le generazioni (meiosi,più frequenti) -possono avere effetti sulla struttura del DNA, la trascrizione, splicing trasporto e stabilità dellRNA, sulla traduzione, sulla struttura e funzionalità proteica

4 Pearson CE et al. doi: /nrg1689 Unstable repeat tracts and the process associated with repeat instability Nature Reviews Genetics (2005) 6,

5 Malattie da triplette Espansione in regioni non codificanti (CGG;GCC,GAA,CTG,CAG) La mutazione causa perdita di funzione o danni a livello di mRNA. Espansione in regioni codificanti: La mutazione porta ad una proteina mutata con guadagno di funzione tossica e/o perdita di funzionalità.

6 La lunghezza del tratto espanso: Dipende dai processi metabolici del DNA. (duplicazione-Riparo e mantenimento perché è un fenomeno presente anche in cellule post-mitotiche). Da luogo al MOSAICISMO genetico Tratti più lunghi sono più soggetti a mutazioni di quelli corti ANTICIPAZIONE GENETICA

7 Gusella JF & MacDonald ME Unmasking polyglutamine triggers in neurodegenerative diseases Nature Reviews Neuroscience 2000, 1:

8 Sequenze ricche in glutammina/aspartato (Q/N): -Sono presenti frequentemente negli eucarioti. Si ritrovano nei lieviti e il loro numero aumenta negli invertebrati e nei mammiferi, indicando che gli organismi più complessi necessitano di queste sequenze ripetute. -Non sono più abbondanti nelle proteine neurologiche -Si ritrovano in proteine importanti per lo sviluppo, e in domini proteici funzionali (interazioni proteiche- riconoscimenti molecolari-signalling). -Non si conosce ancora il loro significato, vi sono diverse ipotesi: Per modulare nuovi domini proteici Per modulare lo sviluppo e aggiungere nuove diversità nella specie.

9 Cell Research (2008) 18:198–213. doi: /cr Features of trinucleotide repeat instability in vivo Irina V Kovtun and Cynthia T McMurray - -germ line (..and meiotic) mutations - - Responsible for inherited diseases - -somatic mutations - - Tumors ? - - Cell specific and/or tissue alterations

10 Espansione in regioni non codificanti: Sindrome da X fragile Causata da unespansione CGG nel 5 UTR del gene fragile X mental retardation (FMR1), localizzato sul cromosoma X. Colpisce solo gli uomini. Sintomi:Ritardo mentale-Ritardo dello sviluppo del linguaggio verbale-Iperattività-Sterilità 6-55 ripetizioni-soggetto sano ripetizioni-premutazione Oltre 200 ripetizioni- patologia

11 Espansione in regioni non codificanti: Sindrome da X fragile A livello molecolare: Lespansione CGG nel 5 UTR del gene causa ipermetilazione della regione richiamando metil DNA binding protein ed enzimi che modificano gli istoni (HDAC) che inibiscono la trascrizione genica

12 Espansione in regioni non codificanti: Sindrome da X fragile- approcci terapeutici Agenti demetilanti (5-azadeoxycytidina o 5-aza)Agenti demetilanti (5-azadeoxycytidina o 5-aza) Inibitori di HDACInibitori di HDAC Uso sinergistico dei 2 composti

13 Espansione in regioni non codificanti: Friedrich Ataxia La mutazione del gene più comune, che codifica per una proteina detta Frataxina, è costituita dalla ripetizione della tripletta GAA situata nel primo introne del gene. La sequenza di queste basi nucleotidiche, che normalmente ha un massimo di 40 triplette negli individui normali, si espande fino ad alcune centinaia nei pazienti malati. Leffetto è una diminuzione marcata di livello di RNA della Frataxina nonchè della quantità di Frataxina espressa, anche se una minima parte viene comunque prodotta. La Frataxina è una proteina mitocondriale e agirebbe regolando il flusso del ferro allinterno dei mitocondri stessi.La perdita di frataxina porta ad accumulo di ferro a livello mitocondriale, aumentata suscettibilità allo stress ossidativo, riduzione della fosforilazione ossidativa.

14 Espansione in regioni non codificanti: Friedrich Ataxia-approcci terapeutici - -antiossidanti (Idebone. Analogo a catena corta del coenzima Q10) - -Chelazione del Fe mitocondriale (pyridoxal isonicotynoil hydrazane- PIH, mobilizza selettivamente il Fe mitocondriale.) - -Modulazione degli istoni (inibitori di HDAC)

15 Gatchel & Zoghbi Nature Rev Genet 2005, 6: 743

16 Sono proteine espresse in modo ubiquitario, ma presentano disfunzioni solo a livello neurologico. Sono caratterizzate da una lenta progressione e sono tutte incurabili. Malattie autosomiche, ad eccezione di SBMA che è legata Al cromosoma X. Caratterizzate da fenomeno dellanticipazione

17 Ross C.A. (1995) Neuron 15:

18 Huntington

19 HD: Htt è localizzata nel citoplasma, assoni, sinapsi e nel nucleo. E coinvolta nello shuttling nucleo-citoplasma e nella regolazione trascrizionale. -si lega al repressore trascrizionale (REST/NRSF=neur on restrictive silencer factor) e lo sequestra nel citoplasma. NRSF non può agire sul DNA sui NRSE presenti su geni come BDNF.

20 HD: -Ha ruolo nel trasporto assonale,interazioni con vescicole, interagisce con diverse proteine responsabili del trasporto intracellulare ed endocitosi. -Regola signalling del calcio

21 X-linked disease associated to a CAG repeat expansion in the androgen receptor gene; The CAG repeat is translated to an elongated polyglutamine tract in the N-terminal transactivation domain of the androgen receptor protein. Motoneuronal cell death. - Clinical features:. Motor cranial nerve deficits, amyotrophy, sensory neuropathy - Types of lesion. Gynecomastia, motor neuron loss in the brain stem and spinal cord. Distal axonopathy, atrophy of dorsal root ganglion root - Neuroanatomic distribution of the lesion. Motor nerve nuclei of brain stem. Anterior horn in the spinal cord, dorsal root ganglia Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA) or Kennedy's disease

22 Zn polyGln P PP P P A S P S P P=phosphorylation A=acetylation S=sumoylation Transactivation domain/(AF-1/AF-5) \ ID NLS AF-2 DNA binding domain H12 Hormone binding domain 5'-UTR Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exons 5/6/7/8 3'-UTR (CAG)n Upstream ORF AUG 1 -UGA AUG 2 mRNA protein polyA normal.....CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG..... mutant.....CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG..... Poletti Front Neuroendocrinol 2004

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24 Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA) Human X-linked disease the AR gene is on X-chrom - Only males affected - gain-of-function of SBMA AR Females may show few clinical symptoms: --> random X-chromosome inactivation ?? --> effect of testosterone ?? TWO Homozygous females --> NO CLINICAL SYMPTOMS Schmidt et al. Neurology (2002) 59: Tg mouse for SBMA AR transgene randomly integrated in the genome - Only males affected (!!) - gain-of-function of SBMA AR Females DO NOT show clinical symptoms --> random X-chromosome inactivation NOT RELATED effect of testosterone --> effect of testosterone Katsuno et al. Neuron (2002) 35: Katsuno et al. Nat Med (2003) 9:

25 No symptoms DiseaseNO Disease Symptoms Cx T

26 Malattie da PolyQ: -perché solo nei neuroni? -perché solo in alcune popolazioni neuronali??

27 Malattie da PolyQ - Patologie che insorgono con letà: Le proteine mutate acquistano tossicità, il tratto polyQ modifica la conformazione e la funzione provocando (GAIN of FUNCTION) Interazioni anomale tra proteine Modificazione della localizzazione cellulare Tossicità cellulare Suscettibilità al taglio proteolitico

28 Malattie da PolyQ - Patologie che insorgono con letà: -Proteine misfolded - GAIN OF FUNCTION -Formazione di inclusioni intracellulari -Alterazioni trascrizionali -Sequestro di proteine importanti Hsps -Alterazioni dei sistemi degradativi -Alterazioni del trasporto assonale -Danni mitocondriali

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30 Expert Reviews in Molecular Medicine: Accession information: Vol. 5; 22 August 2003 PDF PDF Polyglutamine pathogenesis: a multimodal hypothesisDobrila D. Rudnicki and Russell L. Margolis

31 Meccanismi patologici della malattie polyQ 1.Misfolding e aggregazione Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro.

32 Adapted from: Adachi H et al. Widespread nuclear and cytoplasmic accumulation of mutant androgen receptor in SBMA patients. Brain 2005 (doi: /brain/awh381)

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34 Atomic force microscopy shows the presence of fibrillar forms of the purified recombinant AR.Q46 N-terminal fragment expressed in E.Coli Palazzolo I et al., JSB (2008) 108:

35 GFP-AR.Q0GFP-AR.Q22GFP-AR.Q48 in pEGFP-C1 COOH DNA HORMONE DNA HORMONE HINGE N - terminal NH 2 N - terminal DNA HORMONE DNA HORMONE HINGE N - terminal DNA HORMONE DNA HORMONE HINGE GFP GFP GFP

36 Aggregate formation in immortalized motorneurons expressing androgen receptor with an elongated polyglutamine tract GFP-AR.Q0GFP-AR.Q22GFP-AR.Q48 - T + T Simeoni et al. Hum Mol Genet 2000

37 Effects of testosterone on ARpolyQ solubility in SBMA Rusmini et al. Neurobiol Ag 2007

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39 Aggregates induced by 2h T-treatment Redistribution of GFP-AR.Q48 aggregates after ligand removal Michael A. Mancini courtesy by Michael A. Mancini, Dpt. Cell Biology Baylor College of Medicine, Houston, Tx, USA

40 29 cytoplasmic 0.3 neuropil nuclear Neuropil aggregates in immortalized motorneurons expressing androgen receptor with an elongated polyglutamine tract Simeoni et al. Hum Mol Genet 2000 NSC34/AR.Q0 NSC34/AR.Q22 NSC34/AR.Q46 Aggregates of Full-lenght AR.Q48

41 NSC34/GFP-AR.Q0/mtBFP NSC34/GFP-AR.Q22/mtBFP NSC34/GFP-AR.Q48/mtBFP Piccioni et al. FASEB J 2002

42 Mitochondria accumulation in immortalized motorneurons bearing aggregates in cell processes Poletti Front Neuroendocrinol 2004

43 Red = AR.Q48 Green = tubulin Blue = kinesin Neuropil aggregates in immortalized motor neurons expressing SBMA androgen receptor

44 Goldstein L.S. Do disorders of movement cause movement disorders and dementia? Neuron (2003) 40:415-25

45 SBMA AR

46 SBMA AR + TESTOSTERONE Cytoplasmic inclusions toxicity debated

47 SBMA AR + TESTOSTERONE Neuropil inclusions axonal dysfunctions a) Migration from cell soma ? b) "In situ" formation ?

48 Neurite damage fast axonal transport alteration SBMA AR + TESTOSTERONE Neuropil inclusions axonal dysfunctions

49 Axonal degeneration SBMA AR + TESTOSTERONE Neuropil inclusions axonal dysfunctions

50 Cell death SBMA AR + TESTOSTERONE Neuropil inclusions

51 Meccanismi patologici della malattie polyQ 1.Misfolding e aggregazione Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro. 2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico Produzione di corti frammenti tossici.

52 polyQ = 16 polyQ = 112 AR16 HA AR112 HA COOHNH 2 polyQ DBD hormone binding domain Caspase-3 cleavage site Courtesy by DE Merry, TJU, USA Caspase-3 cleavage product of AR identified in spinal cord motoneurons of SBMA patients transactivation domain TRUNCATED FORMS of the ANDROGEN RECEPTOR AR16 HA e AR112 HA

53 AR.Q112 HA DAPI Merge NT pCDNA3+pUC AR_16+pUC AR_112+pUC pCDNA3+Hsp70 AR_16+Hsp70 AR_112+Hsp70 The GFPu protein is a modification of an unstable form of GFP, targeted to the proteasome system by fusion with the following peptide: Ala-Cys-Lys-Asn- Trp-Phe-Ser-Ser- Leu-Ser-His-Phe- Val-Ile-Hys-Leu Courtesy by R KOPITO, USA Mk Mock Q16 Q112 <-- AR16. HA AR112. HA monomer AR112. HA dimer <-- AR112. HA aggregates <-- Detergent (SDS) resistant intracellular aggregates Intranuclear inclusion in immortalized motoneurons expressing AR.Q112 HA

54 Meccanismi patologici della malattie polyQ 1.Misfolding e aggregazione Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro. 2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico Produzione di corti frammenti tossici. 3. Localizzazione nucleare della Proteina tossica Alterazione dellespressione genica e dellorganizzazione nucleare. 4. Hsp-andamento bifasico. Alta espressione nella fase Iniziale, riduzione nelle fasi finali.

55 Meccanismi patologici della malattie polyQ 1.Misfolding e aggregazione Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro. 2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico Produzione di corti frammenti tossici. 3. Localizzazione nucleare della Proteina tossica Alterazione dellespressione genica e dellorganizzazione nucleare. 4. Hsp-andamento bifasico. Alta espressione nella fase Iniziale, riduzione nelle fasi finali.

56 HSP70 sequestration in SBMA AR aggregates

57 Meccanismi patologici della malattie polyQ 1.Misfolding e aggregazione Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro. 2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico Produzione di corti frammenti tossici. 3. Localizzazione nucleare della Proteina tossica Alterazione dellespressione genica e dellorganizzazione nucleare. 4. Hsp-andamento bifasico. Alta espressione nella fase Iniziale, riduzione nelle fasi finali. 5. Alterazione dei sistemi degradativi: proteasome e autofagia

58 Copyright restrictions may apply. Naiki, H. et al. J Biochem : ; doi: /jb/mvp119 Molecular pathogenesis of the polyglutamine diseases and the protein quality control system

59 Goldberg AL Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins Nature 426, (2003) Ubiquitin positive - AR aggregates Misfolded proteins PolyubiquitinationProteasomalDegradation

60 Taylor et al. Science 291:1991, 2002

61 misfolded proteins GFP DEGRON SIGNAL FOR UPP A-C-K-N-W-P-S-S-L-S-H-P-V- I-H-L Ub GFPu degradation GFPu accumulation Effects of testosterone on proteasome functions in SBMA Rusmini et al. Neurobiol Ag 2007 ARpolyQ

62 Nature 441, (15 June 2006) | doi: /441819° Neurodegeneration: Good riddance to bad rubbish Daniel J. Klionsky11

63 Quali approcci terapeutici???????? 1.Fattori neurotrofici (infusione, vettori virali,cell delivery) BDNF, VEGF 2.Trapianti cellulari per ripristinare i circuiti neuronali esperimenti in HD trapianto di cellule fetali striatali,analisi post-mortem ha rivelato che le cellule si erano impiantate ma non si sono riscontrati benefici per la malattia. 3.Somministrazione di RNA antisenso per ridurre i livelli Trascrizionali, per silenziare solo lallele polimorfico.

64 Quali approcci terapeutici???????? 4. Inibitori delle Caspasi zVAD-fmk zVAD-fmk minociclina antibiotico inibitore della caspasi 1 e 3 minociclina antibiotico inibitore della caspasi 1 e 3 5. Overespressione di fattori trascrizionali 6. Inibitori di HDAC Fenilbutirrato, acido valproico Il sequestro di fattori trascrizionali ad azione acetil- trasferasica posso portare ad alterazione dellattività trascrizionale alterando i livelli di acetilazione degli istoni. Questo effetto può essere controbilanciato con linibizione dellattività de-acetilasica.

65 Quali approcci terapeutici???????? 7. degradazione proteica via UPS e autofagia e inibizione dellaggregazione Trealosio- Congo Red, Litio, 17-AAG, overespressione di Chaperone

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67 Litio inibisce inositolo monofosfatasi e porta alla deplezione di inositolo libero e di conseguenza di inositolo tri-fosfato (IP3)

68 Modified from Haslbeck and Buchner (2002) native protein unfolding intermediateaggregate HSP70 sHSPs proteasomal degradation ADP ATP stress

69 Hu et al. J Neurosci Res, Feb 07, DOI:

70 Moreover, HspB8... Lys41 mutations have been linked to either distal motor neurophaty or CMT_2L; Lys41 mutations have been linked to either distal motor neurophaty or CMT_2L; has been found in senile plaques of Alzheimers disease brains (Wilhelmus et al, 2006) has been found in senile plaques of Alzheimers disease brains (Wilhelmus et al, 2006) inhibits in vitro aggregation of amyloid- protein (Wilhelmus et al, 2006) inhibits in vitro aggregation of amyloid- protein (Wilhelmus et al, 2006)

71 Effects of HspB8 on the SBMA ARpolyQ aggregation and on proteasome functions AR actin HspB8 YFPu ARQ23ARQ46ARQ23ARQ46 HspB T [10 -8 ]M ARQ46 HspB T [10 -8 ] YFPu contains the CL1 an hydrophobic peptide that generates a misfolded domain

72 Nature Medicine 11, (2005) doi: /nm Targeting toxic proteins for turnover Albert R La Spada & Patrick Weyd

73 T : 10 nM 17AAG : 330 nM MG132 : 10 M 17AAG: Hsp90 inhibitor / Hsp70 inducer AR YFPu actin EtOH / EtOH EtOH / T T / T 17AAG / T 17AAG / 17AAG+T DMSO MG132 NT EtOH / EtOH EtOH / T 17AAG / T 17AAG / 17AAG+T T / T 17AAG increases the degradation of the misfolded SBMA ARpolyQ

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