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AA 2011/2012 Lezione 6 Adriana Maggi

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Presentazione sul tema: "AA 2011/2012 Lezione 6 Adriana Maggi"— Transcript della presentazione:

1 AA 2011/2012 Lezione 6 Adriana Maggi
DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011/2012 Lezione 6 Bioinformatica nel processo di drug discovery

2 drug discovery process
Bioinformatics in the drug discovery process Alessandro Villa Center of Excellence on Neurodegenerative Diseases Department of Pharmacological Sciences University of Milan

3 Genome-wide studies Recently invented methods allow researchers to analyze the expression of thousands of genes simultaneously using DNA microarrays. Coupling these methods with the results from genome sequencing projects allows researchers to analyze the complete transcriptional program of an organism during specific physiological responses or developmental processes.

4 Cosa sono i chip a DNA I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

5 Cosa sono i chip a DNA I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

6 Cosa sono i chip a DNA I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

7 Come si producono FOTOLITOGRAFIA (in situ):
Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto; SPOTTED MICROARRAYS: Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sull’array, e solo successivamente “spottati” sul supporto.

8 Microarray e Tiling array
MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti Gene 1 Gene 2 TILING ARRAYS: coprono l’intero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…) Gene 1 Gene 2

9 Quali utilizzi hanno MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per l’analisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.) Gene 1 Gene 2 TILING ARRAYS: Utilizzati per analisi unbiased dell’espressione genica (geni non noti e miRNA); ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip) Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per l’individuazione di copy number variations e anomalie del DNA Gene 1 Gene 2

10 Microarray di espressione
Applicazioni Microarray di espressione Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni Il trattamento/ diversa condizione fisiologica / patologia influenzano l’espressione genica? Quali sono i geni differenzialmente espressi? Tiling Arrays Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni Dove si localizza ERalfa? La sua localizzazione è influenzata dal trattamento / condizione fisiologica/ patologia?

11 Microarray Workflow Output Analisi dei Dati Risultati

12 Workflow GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array – Affymetrix
Congelamento Estrazione RNA Retrotrascrizione Microarrays Marcatura Ibridazione GeneChip Mouse Genome Array – Affymetrix transcripts 1 expression array

13 Normalizzazione  RMA file
Output Intensità  CEL file Normalizzazione  RMA file Quasi trascritti conosciuti

14 Output – software di analisi dati
MeV: MultiExperiment Viewer (MeV) da TM4 microarray software suite free Rosetta Resolver System: Genomatix: dChip: Lista di geni differenzialmente espressi nelle due condizioni (veh-trattato; etc.) in un file

15 Analisi dei dati Come otteniamo informazioni da questa lista di geni?
Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati ONTOLOGIES

16 Analisi dei dati GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise. E’ suddiviso in 3 categorie: Processi biologici Funzioni molecolari Componenti cellulari Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari.

17 Phosphomevalonate kinase

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24 Workflow e messa a punto
ChiP On chip Workflow e messa a punto Output Analisi dei dati Risultati

25 Workflow e messa a punto
Crosslinking Workflow e messa a punto Sonicazione Immunopre- cipitazione 500 100 Crosslinking inverso Purificazione DNA Y ChIP-chip LM-Amplification Frammentazione Marcatura Ibridazione

26 Output Cutoff 1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA 2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo 3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff

27 Output Chr 10 BED file

28 Bed Files visualization
UCSC Genome Browser INTEGRATED GENOME BROWSER (IGB)

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30 Add custom track

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32 Bed Files analysis CISTROME ANALYSIS PIPELINE MODULE

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35 Ingenuity Pathway Analysis Software

36 connecting reproductive and metabolic functions:
The role of ERα connecting reproductive and metabolic functions: a genome-wide study.


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