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Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011/2012 Lezione 6 Bioinformatica.

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1 Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011/2012 Lezione 6 Bioinformatica nel processo di drug discovery

2 Bioinformatics in the drug discovery process Alessandro Villa Center of Excellence on Neurodegenerative Diseases Department of Pharmacological Sciences University of Milan

3 Recently invented methods allow researchers to analyze the expression of thousands of genes simultaneously using DNA microarrays. Coupling these methods with the results from genome sequencing projects allows researchers to analyze the complete transcriptional program of an organism during specific physiological responses or developmental processes. Genome-wide studies

4 I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 10 7 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso Cosa sono i chip a DNA

5 I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 10 7 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso Cosa sono i chip a DNA

6 I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 10 7 sonde identiche di pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso Cosa sono i chip a DNA

7 FOTOLITOGRAFIA (in situ): Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto; SPOTTED MICROARRAYS: Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sullarray, e solo successivamente spottati sul supporto. Come si producono

8 Microarray e Tiling array MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti Gene 1Gene 2 TILING ARRAYS: coprono lintero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…) Gene 1Gene 2

9 Quali utilizzi hanno MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per lanalisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.) Gene 1Gene 2 TILING ARRAYS: Utilizzati per analisi unbiased dellespressione genica (geni non noti e miRNA); ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip) Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per lindividuazione di copy number variations e anomalie del DNA Gene 1Gene 2

10 Applicazioni Tiling Arrays Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni Dove si localizza ERalfa? La sua localizzazione è influenzata dal trattamento / condizione fisiologica/ patologia? Microarray di espressione Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni Il trattamento/ diversa condizione fisiologica / patologia influenzano lespressione genica? Quali sono i geni differenzialmente espressi?

11 Workflow Output Analisi dei Dati Risultati Microarray

12 Workflow Congelamento Estrazione RNA Retrotrascrizione Microarrays Marcatura Ibridazione GeneChip Mouse Genome Array – Affymetrix transcripts 1 expression array

13 Output Quasi trascritti conosciuti Intensità CEL file Normalizzazione RMA file

14 MeV: MultiExperiment Viewer (MeV) da TM4 microarray software suite freehttp://www.tm4.org/ Rosetta Resolver System: Genomatix: dChip: Output – software di analisi dati Lista di geni differenzialmente espressi nelle due condizioni (veh- trattato; etc.) in un file

15 Analisi dei dati Come otteniamo informazioni da questa lista di geni? Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati ONTOLOGIES

16 GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise. E suddiviso in 3 categorie: Processi biologici Funzioni molecolari Componenti cellulari Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari. Analisi dei dati

17 Phosphomevalonate kinase

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24 Workflow e messa a punto Output Analisi dei dati Risultati ChiP On chip

25 Workflow e messa a punto Sonicazione ChIP-chip Crosslinking Immunopre-cipitazione Y Crosslinking inversoPurificazione DNA LM-AmplificationFrammentazione MarcaturaIbridazione

26 Output Cutoff 1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA 2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo 3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff

27 Output Chr BED file

28 UCSC Genome Browser INTEGRATED GENOME BROWSER (IGB) Bed Files visualization

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30 Add custom track

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32 CISTROME ANALYSIS PIPELINE MODULE Bed Files analysis

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35 Ingenuity Pathway Analysis Software

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