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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE Silenziamento genico CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11.

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1 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE Silenziamento genico CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA

2 Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI Duplicazione DNA duplicato DNA RNA Trascrizione Maturazione Metabolismo Traduzione PROTEINA FARMACI TRADIZIONALI

3 ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI 1.ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con lm-RNA 2.ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA 3.RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA 4.APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza aminoacidica (competono con lRNA nella interazione tra RNA e proteina) 5.DECOY:DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono con sequenze di DNA nellinterazione DNA- proteina) 6.siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

4 RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con lespressione genica: sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione

5 Silenziamento Post-trascrizionale (1990) Jorgensen 1990: Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche ridotta espressione sia del gene endogeno che del transgene (cosoppressione) A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

6 1993: Viene identificato il primo miRNA nel C. elegans 1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA interference nel C. elegans 1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato dallaccumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt) complementari al gene silenziato. dsRNAs vengono ridotti a piccoli frammenti di Nt 2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico con la trascrizione

7 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello Stanford University University of Massachusetts b. 1959b. 1960

8 Small RNAs miRNAsiRNA Prodotti in modo endogeno Funzione: regolazione dellespressione genica sopprimendo la traduzione o la trascrizione di geni target Exo-siRNA:Introdotti in modo esogeno (virus a dsRNA, transposoni, transgeni) Endo-siRNA: derivati da loci genomici endogeni Funzione principale: rispondere alle minacce esterne sopprimendo la trascrizione genica dellinvasore

9 Interferenza basata su RNA (RNA interference) Attori: Micro RNA (miRNA) precursori a forcina Small interfering RNA (Si) (2 nt 3 protrundenti) Ribonucleasi DICER RISC (RNA driven interference silencing complex) che comprende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a nt dal terminale 5.

10 Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo avvenire diverse volte in quanto lRNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo agire per 3-7 giorni.

11 siRNA sintetico a doppio filamento shRNA plasmidico RNA lungo a doppio filamento miRNA endogeno NT funzione miRNA Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex) Complesso RISC attivato Blocco traduzione funzione siRNA Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi

12 Risc unwinds dsRNA, the ribonuclease in the Ribonuclease complex hydrolizes new targets

13 Nature Reviews Genetics 2007, 8:884 LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA

14 Attività di siRNA a livello del nucleo Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali) Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazione di eterocromatina) Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)

15 RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)

16 RNA interference-mediated heterochromatin assembly siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group. Marjori A. Matzke & James A. Birchler Nature Reviews Genetics 6, (January 2005

17 si RNA – caratteristiche RNA a doppia elica di nt Presenza di terminale 3 più lungo di 2nt Presenza di gruppi OH in 3 Presenza 5 fosfato Alta stabilità nella porzione 5 senso(ricco in GC) Bassa stabilità nella porzione 5 antisenso(ricco UA) Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire lattacco della endonucleasi 2 desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche Non deve essere complementare a zone introniche Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

18 si RNA – caratteristiche

19 siRNA possono diffondere per brevi e lunghe distanze Piante: siRNAs prodotti da Dicer-like 4 nel floema raggiungono cellule fuori dal floema dove possono originare dsRNA (atraverso una RNA Pol RNA dip) che vengono processati in siRNAs secondari che propagano il silenziamento con un processo di amplificazione Animali: trasporto attraverso vescicole secretorie (esosomi)

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22 In rosso: siRNA marcato In blu: nuclei In verde la proteina GAPDH CELLULE HeLa si RNA non specificosi RNA contro GAPDH Trattamento: 48h

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24 siRNA come agenti terapeutici LA DISTRIBUZIONE Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari Difficoltà ad ottenere distribuzione tessuto specifica Degradabilità dovuta a RNasi circolanti (RNA naturale puo essere utilizzato in cervello e polmoni) Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)

25 siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE

26 siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE 1.Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale 2.Somministrazione sistemica: a.iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier) b.RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica c.Utilizzo di vettori virali e non per esprimere lRNA della cellula bersaglio

27 siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2-o-metile nel filamento antisenso) fosforotionati per bloccare esonucleasi coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG

28 Metodi di somministrazione: FISICI Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva Elettroporazione: campo elettrico che facilita la transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel muscolo, retina, giunture artritiche e tumori DI CONIUGAZIONE

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32 Carrier mediated methods Stable nucleic acid lipid particle

33 BIODISTRIBUZIONE

34 Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*, Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin, Gregory J. Hannon, Mark A. Kay* Nature, 2002

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38 siRNA IN STUDI CLINICI

39 Potenziali effetti collaterali della terapia con siRNA: 1.Attivazione del sistema immunitario 2.Effetti off-target 3.Saturazione di vie di silenziamento endogene (miRNA)

40 Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso Similarità: - lunghezza - metodologia di delivery comune - induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale - digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi - possibilità di stabilizzazione con basi modificate - similarità nella biodistribuzione Differenze:- doppio filamento verso singolo filamento - maggiore stabilità della molecola naturale - maggiore efficacia in cellule in coltura - meccanismo di azione mediato da RISC

41 Mantenimento dellidentità cellulare (es. pluripotenza) Lidentità cellulare viene mantenuta silenziando mRNAs che non appartengono allo specifico repertorio della cellula Network di miRNA che controllano specifici pathway (miR-21 regola miRNA che controllano apoptosi: disregolazione di miR- 21 cancro. miRNA che controllano la via di segnale dellinsulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di questo network di miRNA è regolato a seconda della tipologia cellulare) FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI miRNA

42 Tumori: pattern specifico di espressione dei miRNA che permettono di discriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di origine delle metastasi miRNA e cancro

43 Network trascrittoma-microRNA nel cancro

44 miRNA e cancro miRNA oncogeni: miRNA overespressi nei tumori (es. miR-155 è upregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella, del polmone e del pancreas, miR-380-5p reprime p53 nel neuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonista migliora la prognosi) blocco dei miRNA con oligonucleotidi antisenso miRNA oncosoppressori: miRNA ridotti o mancanti nei tumori. La loro overespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. miR-15a-16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfocitica cronica, adenomi della prostata e dellipofisi) miRNA mimics o vettori virali

45 Strategie per terapie anti-cancro basate su miRNA: 1.Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi antisenso 2.Costrutti Locked nucleic acid (LNA) 3.miRNA sponges 4.miR-mask 5.Small molecule inhibitors 6.Ripristinare lespressione di miRNA oncosoppressori 7.Riprogrammare le cellule cancerogene

46 Limiti e vantaggi della terapia con miRNA

47 Riferimenti bibliografici Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884 Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556 Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic administration. Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142 Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery 8, (February 2009) Carthew et al., Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell vol 136, Feb 2009 Garzon et al., Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nat reviews vol 9 (2010) Semple et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotech vol 28 Feb Kosik et al., MicroRNAs and cellular Phenotipy, Cell vol 143, 2010


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