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UNIVERSITA’ DI ROMA “LA SAPIENZA" FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di laurea triennale in scienze biologiche Elaborato finale.

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Presentazione sul tema: "UNIVERSITA’ DI ROMA “LA SAPIENZA" FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di laurea triennale in scienze biologiche Elaborato finale."— Transcript della presentazione:

1 UNIVERSITA’ DI ROMA “LA SAPIENZA" FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di laurea triennale in scienze biologiche Elaborato finale Ingegnerizzazione di plasmidi per recupero di terre rare tramite ceppi di S. cerevisiae Candidata: Emma Tosti Relatore: Daniela Uccelletti A.A

2 Crisi recupero metalli terre rare: la Cina che ne produce circa il 95%, ne ha ridotto l’esportazione PRINCIPALI TECNICHE DI RECUPERO: Tecniche tradizionali chimico-fisiche Tecniche biotecnologiche di bioadsorbimento

3 Attraverso biomassa (lieviti, alghe e funghi) Legame tra ioni metallici e componenti superficiali molecolari (meccanismo metabolismo- indipendente) Basso costo e basso impatto ambientale

4 Si ottiene facilmente (birra, pane etc…) Crescita veloce e su terreno poco costoso Microrganismo GRAS Geneticamente manipolabile Genoma interamente sequenziato Modello di parete cellulare di lievito

5 STRATEGIA DI CATTURA DEL LANTANIO TRAMITE PARETE CELLULARE DI S. cerevisiae APPROCCIO I APPROCCIO II Mutagenesi e screening ceppo Rim20  Surface display: proteine leganti Ca++ Calmodulina ancorata alla parete tramite GPI di Gas1

6 -Percentuale di sopravvivenza delle cellule dopo trattamento tramite metodo delle CFU APPROCCIO I Studio dose-risposta agli UV di ceppo mutante di S. cerevisiae Rim20 

7 Screening di circa 1500 colonie tramite metodo dell’Alcian Blue: colorante avente proprietà cationiche leganti cariche anioniche sulla parete di lievito 1500 colonie: 12 risultano avere un’aumentata carica negativa sulla parete ABR (mg/5x10 7 cell) Colonie isolati

8 APPROCCIO II CLONAGGIO CMD-1 IN p426GPD: Amplificazione per PCR da cDNA stampo di C.elegans PRIMERS M: λ DNA (Pst I) Forward: presequenza αfactor/5’ di CMD-1 Reverse: sito restrizione EcoRI/3’ di CMD-1 senza codone di stop (C-terminale)

9 Subclonaggio in pGEM -T Easy Trasformazione in cellule competenti di E. coli Recupero DNA plasmidico e digestione con EcoRI (banda evidente a ~ 500 bp) Estrazione banda da gel d’agarosio Gel pGEM con ultimi 3 cloni positivi (banda a ~500 bp)

10 Ligazione in p426GPD purificato e digerito con EcoRI (con banda evidente a ~ 500 bp) Trasformazione in cellule competenti di E. coli

11 Recupero DNA e digestione con EcoRI (banda a ~ 500 bp) Controllo orientamento con SacI-BstXI (banda a ~ 800 bp) Gel p426GPD-CMD-1 con secondo clone positivo con banda a ~ 500 bp Gel p426GPD-CMD-1 con secondo clone positivo per controllo orientamento con banda a ~ 800 bp

12 CLONAGGIO GAS1-GPI IN p426GPD-CMD1 Amplificazione gene GAS1-GPI per PCR da DNA stampo di BY4741 di S. cerevisiae (wt): PRIMERS Forward: sito restrizione HindIII/5’ di GAS1-GPI Reverse: sito restrizione XhoI/3’ di GAS1-GPI (N-terminale) Controllo gel PCR GAS1-GPI

13 Subclonaggio nel pGEM-T Easy Trasformazione in cellule competenti di E. Coli Recupero DNA plasmidico digerito con HindIII-XhoI Gel pGEM GAS1-GPI digerito HindIII-XhoI con primo e terzo clone positivo: banda a ~ 400 bp

14 Estrazione banda da gel d’agarosio Ligazione in p426GPD-CMD1 purificato e digerito HindIII-XhoI Trasformazione in cellule competenti di E. coli Successiva analisi dei cloni

15 Ingegnerizzazione di ceppi di S. cerevisiae per bioadsorbimento del lantanio COSTRUZIONE E OTTENIMENTO PLASMIDE p426GPD-CMD1 Trasformazione plasmide p426GPD-CMD1 nei ceppi di S. cerevisiae Analisi con spettroscopia ad assorbimento atomico per la determinazione del Lantanio

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