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Metodi enzimatici in diagnostica clinica. Vantaggi -veloce -molto specifico Metodi di - Misura in continuo (più facili e più utili) - Misura a tempo fisso.

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1 Metodi enzimatici in diagnostica clinica

2 Vantaggi -veloce -molto specifico Metodi di - Misura in continuo (più facili e più utili) - Misura a tempo fisso Influenze - pH - temperatura -forza ionica Enzymatic reaction-based assays

3 Michaelis-Menten enzyme kinetics KmKm

4 A BC E prim XY Spesso non è possibile un singolo enzima-reazione sequenziale E ind t ~ 0 [B] << K m B, v ind = V ind.[B]/K m B - 1 st order reaction t > 0 k.[E prim ] = V ind v ind = V ind.[B]/(K m B + [B]) = V ind /(K m B /[B] + 1) [B] 100.K m B - error 1% It is necessary to use 10 to 100-fold excess of E ind over E prim !!!

5 H HH NAD(P)H assay - Wartburg optical test A + NADH + H + B + NAD + Tutte le deidrogenasi NAD o NADP dipendenti utilizzano queso metodo

6 Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company Test ottico accoppiato A + BC + D C (oD) +NADHE + NAD+ E possibile accoppiare una terza reazione

7 Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company Calcolo attività enzimatica 1 UI =1 micromole di substrato trasformato/min = c / min Attività enziamtica (mUI / ml) = A V 1000 min v d A = variazione assorbimento a = fattore di conversione alle mUI V = volume totale della miscela di reazione = coeff. Estinzione molare di 1 mole/ml di NADH a cm 2 / mole v = volume del campione (ml) d = cammino ottico (1cm)

8 NH 4 + CO 2 esempi

9 NO 3 - H 2 O 2 SO 3 2-

10 Ethanol, Acetaldehyde Acetate

11 Ascorbate 578 nm

12 Citrate Malate Fumarate Oxalate, Formiate

13 Succinate

14 Lactate Pyruvate 2-Oxoglutarate L-Glutamate L-Glutamine

15 Glucose Fructose Sucrose

16 Glycerol Triacylglycerols Free fatty acids 546 nm

17 Cholesterol Bile acids 405 nm Urea 576 nm

18 AMP/ADP ATP

19 NAD(P)H - bioluminescence ATP - bioluminescence h. (493 nm) h. (562 nm) Metodi in luminescenza

20 Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company Diagnostica nellischemia cardiaca Transaminasi glutamico ossalacetica (GOT) GOT aumenta dopo 6 ore linfarto max a 36 ore livelli normali 5gg

21 Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company Creatina chinasi Fosfocreatina + ADPcreatina + ATP Aumenta dopo 3 ore dallinfartomax h livelli normali 3gg Creatina fosfato

22 Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company Lattico deidrogenasi Aumento entro 2 ore max 60 ore ritorno alla norma lento Troponine cardiache: molto specifiche per il cuore

23 Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company Dosaggio del substrato 10 ml di NADH 20 mM (Ci) vengono messi in 2 ml di soluzione tampone (CfNADH = 100 µM) 10 ml di piruvato prelevati dal liquido biologico (siero) 10 ml di lattico deidrogenasi Piruvato + NADH + H+ lattato + NAD+ Sapendo che le molare di NADH è 6,22 mM-1 cm-1 0,1 mM di NADH avrà un assorbanza di 0,622 (Ai) Nella lettura Af ottengo: 0,322 A = l C A = 0,622 – 0,322 = 0.3 C = A/ l = 0.3 / 6,22 mM-1 cm-1 x cm = 0,48 mM = 48 mM Le micromoli di piruvato nei 2 ml della cuvetta saranno uguali a 48 mM x 2 ml / 1000 = 0, 096 mmoli [piruvato] = 0,096 / 10 ml (volume usato) = 9,6 mM (concentrazione del piruvato)


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