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STUDIO ESPRESSIONE GENICA. Regolazione trascrizionale Regolazione post-trascrizionale Meccanismi epigenetici e controllo dellespressione genica a lunga.

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Presentazione sul tema: "STUDIO ESPRESSIONE GENICA. Regolazione trascrizionale Regolazione post-trascrizionale Meccanismi epigenetici e controllo dellespressione genica a lunga."— Transcript della presentazione:

1 STUDIO ESPRESSIONE GENICA

2 Regolazione trascrizionale Regolazione post-trascrizionale Meccanismi epigenetici e controllo dellespressione genica a lunga distanza I meccanismi di controllo usati per regolare lespressione dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli utilizzati dagli altri organismi.

3 Cellula umana contiene circa geni RNA genes Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( ˜ 5000 geni) Geni housekeeping Geni tessuto - specifici metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

4 NUCLEO controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto- specifico controllo del trasporto mRNA controllo della stabilità degradazione traduzione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINA attiva o inattiva DNA Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina Trascritto primario (precursore) mRNA controllo traduzionale CITOPLASMA Esistono molteplici livelli di regolazione dellespressione genica negli eucarioti

5 Meccanismi epigenetici Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. Metilazione del DNA; Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. Modificazioni degli istoni; Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

6 Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. Lestensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite linibizione dellespressione genica a livello trascrizionale.

7 I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono marcati da isole CpG al 5. In queste regioni la frequenza di CpG è uguale a quella attesa nel DNA totale (40% GC), nella restante parte del genoma è invece più bassa del 20% rispetto allatteso Nel genoma umano il 56% dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping ed il 40% dei geni con espressione tessuto-specifica I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi Quali regioni sono bersaglio della metilazione?

8 Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni Importanza della struttura modulare e delle interazioni proteina-proteina

9 I residui amminoacidici allN-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione. Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni

10 Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. Lacetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

11 CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA Trascrizione attiva Trascrizione inattiva

12 Controllo Trascrizionale Il metodo principale col quale avviene il controllo dellespressione genica negli eucarioti è una trascrizione selettiva, che si ottiene grazie a specifiche DNA binding proteins.

13 Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei geni eucarioti e controllata da numerosi elementi TATA Basal tr. machinery TBP TFIIs Pol.II PROMOTORE PROSSIMALECORE ~ -200 ~ -50 ENHANCER (~ 1-10 kb) Perche? LA CROMATINA

14 Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori.

15 Il promotore del gene umano dellinsulina Nero: fattori ubiquitari Rossi: fattori specifici delle cellule beta pancreatiche

16 Il complesso trascrizionale dellRNA polimerasi II viene assemblato a tappe successive (in vitro) Lodish TBP + TAFs=TFIID

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18 Esempio di come i diversi elementi di controllo di un gene possono integrarsi a livello del promoter core

19 Zinc finger ( motivo a dita di zinco) Leucine zipper (serratura a leucina) homodomain (omodomini) assomigliano strutturalmente a regolatori batterici di tipo helix-turn-helix Helix-loop-helix (elica-ansa-elica). Le proteine appartenenti a questa classe, anche nota come HLH possono formare omo o etero- dimeri Recettori steroidei Classi di fattori trascrizionali

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25 Consensus response element (RE)Response to:Protein factor which recognizes RE (T/G)(T/A)CGTCAcAMPCREB (also called ATF) CC(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)GGSerum growth factorSerum response factor TTNCNNNAAAInterferon-gammaStat-1 TGCGCCCGCCHeavy metalsMep-1 TGAGTCAGPhorbol estersAP1 CTNGAATNTTCTAGAHeat shockHSP70, etc.

26 Metodi per studiare i fattori trascrizionali EMSA DNA footprinting Trasfezioni transienti Geni reporter

27 Gel Mobility Shift Assay (Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMSA)

28 DNA Footprinting

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30 Saggio per la Beta-galattosidasi

31 CAT

32 Mg 2+ Luciferasi N SN S OH COOH + ATP + O 2 LUCIFERINA N SN S -O-O + AMP +PP i + CO 2 + LUCE OXY-LUCIFERINA O-O- Luciferasi

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