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ANTICORPI MONOCLONALI. Pure single Ab After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies. Each B cell produces only one.

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Presentazione sul tema: "ANTICORPI MONOCLONALI. Pure single Ab After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies. Each B cell produces only one."— Transcript della presentazione:

1 ANTICORPI MONOCLONALI

2 Pure single Ab After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies. Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen. If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture. Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody. Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p m m m m Monoclonal antibodies Cell fusion Spleen cells + Myeloma x Antiseum Antigen Immunization A mixture of all Ab B cell

3 Antibodies Polyclonal Monoclonal Antibodies that are collected from sera of exposed animal recognize multiple antigenic sites of injected biochemical. Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured. Secreted antibodies are collected from culture media recognize ONE antigenic site of injected biochemical

4 Hybridoma 1975 Kohler and Milstein Multiple myeloma (human disease) Bence Jones proteins in urine Fusions generated by Sendai virus or PEG

5 Creation of monoclonal antibodies (mAbs) 1. Hyperimmunize mouse with Ag 2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG) 3. Limiting dilution (96 wells) to fractionate fused cells in HAT media selection B cells die (mortal, HGPRT-positive) Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway) Fusions live (HAT Resistant and immortal) HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).

6 Hybridoma selection (HAT media) The de novo pathway can be inhibited using aminopterin, which inhibits the transfer of methyl groups from activated dihydrofolic acid. cells need Hypoxanthine and Thymine as sources of purines and pyrimidines for the salvage pathway. Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway. Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway.

7 Expand in mice or expand in vitro in vitro material is less concentrated and contains bovine serum ascites fluid contain high [mAb] and minor contamination with mouse Ig

8 How to purify your MAb Monospecific antibodies Affinity Purification Or use Ag or epitope to make affinity column

9 IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI Protein purification Identification and isolation of cell sub- populations using fluorescence cell sorting. Tumor detection and imaging Tumor killing Diagnostic reagents. Drug Detoxification Catalytic antibodies

10 IMMUNODIFFUSIONE

11 Immunoprecipitation At appropriate ratio of antigen:antibody, complex forms an insoluble aggregate. Technique can be used to purify specific protein from a mixture Co-immunoprecipitation – interacting proteins also found in the immunoprecipitate

12 Determinazione delle concentrazioni relative di anticorpi o di antigeni Confrontare diversi antigeni tra loro Stabilire la purezza di un preparato antigenico Impieghi dellimmunoprecipitazione

13 Immunodiffusione Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione. Immunodiffusione radialeImmunodiffusione radiale Immunodiffusione doppiaImmunodiffusione doppia immunoelettroforesiimmunoelettroforesi

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15 Diagrammi di possibili Modelli di precipitazione con la doppia immuno- diffusione eseguita su un antisiero e 2 diversi preparati antigenici A: epitopi identici B:nessun epitopo in comune C:identità parziale

16 IMMUNOELETTROFORESI Archi di precipitazione Separazione elettroforetica degli Ag

17 Determinare se un paziente produce quantità troppo basse di Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze Si può vedere se produce se produce un eccesso di alcune proteine, quali albumina, immunoglobuline

18 Immunoelettroforesi quantitativa Ponendo in grafico laltezza degli archi contro la concentrazione Si otterrà una retta di taratura che può servire per determinare la concentrazione di Ag in un campione incognito

19 TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE (Presenza o assenza di gonadotropina)

20 IMMUNOFLUORESCENZA

21 Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti

22 Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza donda (eccitazione)e la emettono ad unaltra lunghezza donda (emissione). Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso la valutazione della luce colorata emessa in seguito alleccitazione a una determinata lunghezza donda La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senza modificarne la specificità Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina

23 Immunofluorescense Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction IFA of Ehrlichia chaffeensis in DH82 cells, 400X Very good rapid diagnostics

24 Citofluorimetria e fluorescenza Queste tecniche si basano sullimpiego di Ab fluorescenti a hanno carattere qualitativo FACS (fluorescence-activated cell sorter) Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene registrata. Le cellule che possiedono lAb fluorescente legato ai loro Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto rispetto al raggio laser. Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa

25 SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab

26 DIAGNOSTICA

27 ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Test antigen Test antiserum

28 Visualization of reaction

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30 ELISA to test MAb production itself formerprojects_im... The dark blue spot represents a positive clone. The light blue spots are positive controls, the next two wells to the right are negative controls

31 SAGGIO ELISPOT

32 Saggio radio-immunologico Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti anticorpali. –Ab + Ag*Ab/Ag* –Ab/Ag* + AgAb/Ag Ab/Ag* E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura, % conc. Ag Marcato legato a Ab Conc. Ag non marcato Tratto lineare

33 FRAZIONI DI Ab

34 The Fab fragment contains the antigen binding site Could be cleaved out by papain digest; pepsin digestion even better, as it produces F(ab)2 www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm Often it is enough for diagnostic purposes – and it is easier to produce Anti Botulinum toxin Equine FAB fragment product made by DoD at time of Gulf War, anti-ABCDEFG Hinge region

35 Single chain Fv fragments The size and specificity of the ScFv fragment may allow for attachment to cryptic sites

36 IMPIEGHI COME FARMACI

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38 About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptormetastatic Determination of HER2-protein overexpression (semiquantitative DAKO Hercep Test) Fluorescence in situ hybridisation (FISH) of HER2 amplification facets/9/herc.htm

39 Herceptin (TrastuzuMAb) anti-HER MAbs Approved!

40 Problemi con la terapia basata su mAb Gli Ab di topo sono visti come estranei dal sistema immunitario umano Innesco della risposta immunitaria contro gli HAMA (human anti-mouse antibody) Danni nellospite mAb causerebbero meno problemi (volontari cercasi??!!) Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo

41 Anticorpi chimerici: Combinazione della regione variabile di topo con la regione costante di uomo Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli aa della regione ipervariabile di topo con il resto di Ab umano

42 Anticorpi umanizzati Clone those genes and express them as a recombinant protein in the protein expression system Sales of Rituxan/ MabThera by Year intragrad/micro/micro297/4

43 Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani

44 intragrad/micro/micro297/4 Xenomouse (topo con IgH e Igk umani) Abgenix

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46 Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif ricin from the castor bean (Ricinus communis). Antibody is tumor-specific

47 Only the targeted tumor cells are killed by the toxin Common side effect – Vascular leak syndrome. Could be relieved by usage of mutated toxin Bunch of other toxins could be used

48 Saponin (from soapwort) : DFlavell/djf2.htmwww.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm potent single chain ribosome inactivating protein Goal: treatment of leukemias and lymphomas For T-cell leukemia could be targeted via CD7

49 OctreoScan in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer, which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells

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