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By NA Lezione 3 Test - Sreening - Acondroplasia. By NA Cose lanalisi analisi genetica Lanalisi individua il genotipo di individui a rischio per ben definite.

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1 By NA Lezione 3 Test - Sreening - Acondroplasia

2 By NA Cose lanalisi analisi genetica Lanalisi individua il genotipo di individui a rischio per ben definite patologie. Oggi possono essere identificate anche prima della nascita piu di 300 malattie genetiche. La maggior parte sono rare e lanalisi viene fatta solo quando ce una indicazione precisa

3 By NA Cose lo screening Lo screening genetico si effettua su una popolazione o su un gruppo di individui non imparentati. Non si possono fare screening per tutte le possibili malattie: si effettua su una popolazione in cui una particolare patologia ha unincidenza significativa: es.Tay-Sachs nei canadesi francofoni o negli ebrei orientali. Lanemia falciforme nel bacino mediterraneo, la talassemia

4 By NA Quando eseguire i test genetici I Rischio noto di una particolare malattia in un feto o in sospetti portatori * Se la mutazione e gia nota perche si e studiato il precedente affetto e relativamente semplice. Se la patologia e recessiva le mutazioni da ricercare potrebbero essere 2 * Se la mutazione non e nota la strategia e piu complessa e potrebbe non portare a dei risultati utili: come per CF. In questo caso si ricorre al linkage

5 By NA Quando eseguire i test genetici II Screening nei neonati * La popolazione da testare e ben identificata * Lanalisi e economica e rapida * E possibile anche nel caso degli affetti intervenire per impedire la comparsa della patologia: fenilchetonuria

6 By NA Quando eseguire i test genetici III * Confermare o smentire una diagnosi clinica: penetranza, eterogenita genetica, fenocopie * Identificare lo stato di portatore nel caso di patologie ad insorgenza tardiva o di suscettibilita a patologie tumorali * In futuro identificare geni che predispongono alla comparsa di patologie complesse * Confermare il coinvolgimento nella patogenesi di una malattia di un gene candidato clonato

7 By NA Premesse

8 By NA Premesse

9 By NA Quando non si e trovato niente di noto Quando si sono testate le mutazioni gia note e non si e arrivati a definire la presenza della mutazione, prima di ricorrere al sequenziamento vero e proprio di tutto il gene, si puo ricorrere a tecniche per evidenziare differenze fra la sequenza normale e la mutata, anche senza conoscerne la sequenza (SSCP, DDGE....) Il principio su cui si basano e quello per cui una variazione anche di una sola base modifica la conformazione del DNA in condizioni sperimentali definite,o evidenziano grosse alterazioni della sequenza (delezioni, duplicazioni...) attenzione pero a variazioni polimorfiche Polimorfismo: variazione la cui frequenza sia maggiore di 0,01(1%) Eterozigosi media per il DNA genomico umano:~ 0,0037 (0,37%). Cio significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse

10 By NA Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking) Prerequisiti: 1) Malattia mappata per poter identificare in banca dati marcatori il piu strettamente associati. 2) la struttura della famiglia e la disponibilita dei campioni devono permettere di ricostruire la fase. Tre fasi: 1)Distinguere i due cromosomi(aplotipi) del(i) gentore(i) che possono aver trasmesso il gene malattia 2) Determinare la fase 3) definire quale aplotipo ha ereditato il probando dai genitori Questa logica si applica a fenotipi con qualunque tipo di ereditarieta. Linformativita dei marcatori non e piu un problema: ci sono oggi microsatelliti altamente informativi mappati su tutto il genoma. Il limite piu grosso e dato dalla struttura della famiglia Non si puo fare lanalisi diretta della mutazione: gene non clonato o non si sono individuate mutazioni nella sequenza del gene

11 By NA Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking) Patologia dominante (espressivita variabile, penetranza risotta, insorgenza tardiva) 1) richiesta del test 2) identificato un marcatore per cui II3 e eterozigote I1I2 II3 II4 III1 III ) identificare con quale allele segrega il fenotipo (fase) I1I2 II3 II4 III1 III ) identificare il genotipo di III2, analizzando lei e II4 I1I2 II3 II4 III1 III Quali sono i risultati possibili?

12 By NA Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking) Risultati possibili I1 I2 II3II4 III1III III2: 2-1 o 2-3 NON eportatrice, perche in questa famiglia la regione mutata e identificata dallallele 1 III2: 1-1 o 1-3 E portatrice, perche in questa famiglia la regione mutata e identificata dallallele 1 ATTENZIONE: e importante la segregazione allinterno della famiglia e non il particolare genotipo: se III2 avesse 2-1 cioe lo stesso genotipo della madre malata, non sarebbe portatrice Patologia dominante (espressivita variabile, penetranza risotta, insorgenza tardiva)

13 By NA Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking) Linformativita dei marcatori non e piu un problema: ci sono oggi microsatelliti altamente informativi mappati su tutto il genoma il limite piu grosso e dato dalla struttura della famiglia Stesso fenotipo recessivo e segregazione in 4 famiglie diverse Impossibile il test perche non ce il DNA di riferimento dellaffetto %N, 50% affetto:non si puo definire di chi sono gli alleli ereditati dal feto. Lallele 2 del feto e lo stesso della sorella? Nessuna previsione come prima Normale 1-1 Portatore 2-1 Affetto 2-2 Lerrore diagnostico puo venire dalla ricombinazione che deve essere la piu bassa possibile

14 By NA Diagnostica I le informazioni sulle malattie sono reperibili oltre che come PDF anche direttamente al sito cliccare su laboratory directory nella barrahttp://www.genetests.org:

15 By NA il sito

16 By NA il sito

17 By NA il sito

18 By NA Acondroplasia Velazquez

19 By NA Acondroplasia I Il gene coinvolto in questa patologia e FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor-3 ), che mappa in 4p16.3 (telomero del cromosoma 4), contiene 19 esoni, e lungo 16.5 Kb ed e lunico le cui mutazioni siano state collegate allacondroplasia. Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo configurare come aumento di funzione Il recettore ha 3 domini Ig-like, un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico tirosinochianasico

20 By NA considerazione importante Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo configurare come aumento di funzione Bisogna sempre ricordare che la dominanza attiene al fenotipo e quindi e leffetto della mutazione sulla funzione del prodotto che provoca la dominanza del fenotipo mutato sul wildtype. Quindi leffetto della mutazione dipende da: * quale e la funzione del wt: e sensibile alla dose sia in piu che in meno? e quindi: la mutazione provoca un aumento o una diminuzione dellattivita del prodotto? Questo vale per tutti i geni e i loro prodotti !!!

21 By NA Acondroplasia II Nel caso di una coppia in cui uno dei partner sia affetto, il rischio di ricorrenza e 50%, se entrambi sono affetti: 25% non affetti, 50% affetti, 25% letali per lomozigosi. Perche la diagnosi molecolare? 2per confermare un sospetto diagnostico 2per una diagnostica prenatale ( mosaicismo germinale) Sembrerebbe collegata con aumentata eta paterna, proprio per il relativamente alto tasso di nuove mutazioni. Il mosaicismo germinale sembra essere la causa delle rare famiglie con ricorrenza Lacondroplasia e una patologia originata ad un anormale sviluppo osseo. E una patologia autosomica dominante, oltre l80% degli affetti hanno genitori con statura normale e sono originati da una mutazione de novo, quindi il rischio di ricorrenza e basso (attenzione al mosaicismo germinale)

22 By NA Acondroplasia III Analisi di mutazioni note: sono note 2 mutazioni patogenetiche che vengono ritrovate (una sola!) nel 99% degli affetti. Entrambe sono a carico del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a causa della sostituzione della prima base della tripletta, la sostituzione di una glicina con una arginina nel dominio transmembrana G380R. 2 Nel 98% e una transizione G>A 2 nell1% e una trasversione G>C 2 il restante 1% puo essere dovuto ad altri alleli rari: / G>T codone 375 glicina>cisteina / A>G codone 650 lisina> glutamina (letale:nanismo thanatoforo) / Per tutte la tecnica e la ARMS o analoghe: la sequenza wt e mutata sono note. E se non ci sono le mutazioni note? e si deve fare una diagnosi prenatale?

23 By NA Test per mutazioni note Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS (Amplification Refractory Mutation System): si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTE in una i primer sono entrambi per la sequenza normale, nellaltra un primer e un ASO specifico per la mutazione. Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si appaiano. Di solito il test e multiplex utilizzando primer che permettano di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.

24 By NA 1.I multiplex Allele A MAllele B NAllele C N F508NAllele D NAllele E N Allele A NAllele B NAllele C N F508NAllele D MAllele E N Reazione 1Reazione 2 DNA+ primer A m B m C m F508 n Contr D m E m F508 M Contr. A M F508 n Contr, D M Contr. Reazione 1Reazione 2 PCR 1 2 AM DM 508N Contr. CFTR

25 By NA Acondroplasia IV * Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e noto): e presente in altri soggetti sani della famiglia? Sequenziamento tenendo presente che se si trova una mutazione: * Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla funzionalita: e presente in soggetti sani della famiglia? * Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene innocuo sulla funzionalita: e presente in soggetti sani della famiglia? * Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e accertato essere innocuo sulla funzionalita (come?)

26 By NA Acondroplasia V Sequenziamento: si e risposto SI a tutte le domande precedenti, quindi non si e trovato niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire? Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione ad un altro locus, Diagnosi errata o il prodotto del secondo ipotetico locus interagisce con il primo e quindi il fenotipo e uguale Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione non visibile perche si manifesta durante la maturazione dellRNA. E quindi che faccio? Nel caso dellacondroplasia lecografia prenatale mi aiuta e non e il caso di ricorrere al linkage perche non esistono portatori silenti: la penetranza e totale e non ce espressivita variabile.

27 By NA Acondroplasia VI

28 By NA Acondroplasia VII


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