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by N.A. Identificazione di geni nei mammiferi by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l organizzazione.

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Presentazione sul tema: "by N.A. Identificazione di geni nei mammiferi by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l organizzazione."— Transcript della presentazione:

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2 by N.A. Identificazione di geni nei mammiferi

3 by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione / identificare i geni e la loro funzione studiarne l evoluzione attraverso il confronto con altri genomi Studiare un genoma

4 by N.A. Dalla genetica alla genomica: timeline di unaevoluzione concettuale

5 by N.A Da Mendel al DNA

6 by N.A. Per la prima volta è indagato scientificamente il problema della trasmissione dei caratteri: Mendel scopre le leggi dellereditarietà. Mendel, G. Versuche über Pflanzen-Hybriden in Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Abhandlungen Brünn, 4, 3-47, (1866). Gli individui possono essere selezionati e incrociati scientificamente, ma non cè ancora una spiegazione molecolare del fenomeno : le leggi di Mendel

7 by N.A. La biochimica Miescher, F. "Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen, Hoppe- Seyler's medicinisch-chemische Untersuchungen, 4, , (1871). 1869: Miescher per la prima volta isola una sostanza che chiama nucleina perchè abbondante nel nucleo cellulare e scrive larticolo La composizione chimica delle cellule del pus. Più tardi la nucleina, caratterizzata chimicamente, si dimostrerà un acido, le cui componenti sono desossiribosio, fosfati e basi azotate. La sostanza è ribattezzata DNA.

8 by N.A. La citologia 1903: Sutton propone la teoria cromosomica dellereditarietà, correlando il comportamento in meiosi dei cromosomi scoperti da Flemming nel 1882 con le modalità di trasmissione dei caratteri mendeliani. La teoria sarà dimostrata da Morgan nel 1910 con studi in Drosophila. Sutton, W. The chromosomes in heredity, Biological Bulletin, 4, , (1903).

9 by N.A. Avery, O.T., MacLeod, C.M. and McCarty, M.Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, J. Exp. Med., 79, , (1944). 1944: Avery, McCarty e MacLeod identificano nel DNA la molecola della informazione ereditaria: costituisce il principio trasformante che rende lisce le colonie di batteri a colonie rugose. Il principio trasformante : il DNA

10 by N.A Da Watson e Cric allidea del sequenziamento

11 by N.A. 1953: Watson e Crick propongono il modello a doppia elica per la molecola del DNA. Watson, J.D. & Crick, F.H.C. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, 171, , (1953). Base molecolare nota. Informazione illeggibile! La doppia elica

12 by N.A. 1966: Nirenberg, Khorana e Holley determinano il codice genetico -> a ogni tripletta corrisponde un amminoacido e viceversa (... quasi). In questo stadio della genetica è più facile sequenziare le proteine e dalla successione degli aminoacidi dedurre la sequenza nucleotidica. UUU UUC F fenilal UCU UCC S serina UAU UAC Y tirosina UGU UGC C cisteina UUA UUG L leucina UCA UCG S serina UAA UAG STOP UGA UGG STOP W triptof CUU CUC L leucina CCU CCC P prolina CAU CAC H istidina CGU CGC R arginin CUA CUG L leucina CCA CCG P prolina CAA CAG Q glutam CGA CGG R arginin AUU AUC I isoleuc ACU ACC T treonina AAU AAC N asparag AGU AGC S serina AUA AUG I isoleuc M metion ACA ACG T treonina AAA AAG K lisina AGA AGG R arginin GUU GUC V valina GCU GCC A alanina GAU GAC D Acaspar GGU GGC G glicina GUA GUG V valina GCA GCG A alanina GAA GAG E Acgluta GGA GGG G glicina UCA G A G C U U C A G U C A G U C A G U C A G Il codice genetico

13 by N.A. 1968: purificazione del primo enzima di restrizione. 1969: le università americane si collegano ad ARPANET, lantenato di INTERNET 1973: mappa di restrizione di SV40 e clonaggio del primo plasmide DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro ottenuto dopo trasferimento e ibridazione con sonda marcata radioattivamente(P32) 1974: Ed Southern mette a punto la tecnica che prendera il suo nome: il Southern Blot. Tappe

14 by N.A. 1977: Gilbert e Sanger inventano un sistema per sequenziare rapidamente una molecola di DNA. Si determinano alcune decine bp/mese uomo (mu). 1983: grazie alle nuove sonde e agli RFLP viene mappato per linkage il locus della Corea di Huntington. Si apre la possibilita di mappare geneticamente anche quegli organismi non accessibili dalla genetica classica basata sugli incroci e si puo fare il linkage utilizzando il fenotipo del DNA 1985: Mullis concepisce la PCR (polymerase chain reaction) 1986: Hood realizza il primo sequenziamento automatico (-> Mb/mu) 1988: Vengono costruiti gli YAC che possono contenere fino a 2Mb Tappe

15 by N.A. Tappe : gli STS 1989: L automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (~200pb) clonate a caso da cui ricavare primers per screenare con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui. Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro DNA genomico Clonaggio Sequenziamento GACTTAG CATAGCA ~200bp STS A,B,C.. scelta dei primers x A,B,C.. screening library con PCR A+,B-,C+.. A-,B+,C+.. B+,D+,G+ H+,F+,T-..F+,T-,Q+.. H F* Q A* C B* D G* mappa fisica: contiguo 1 2 A C B D G H F Q mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e F-A-G A C B D GH F Q I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi....

16 by N.A. 1992: I BAC:possibilita di clonare frammenti molto grandi (fino a 200Kb) e stabili a differenza degli YAC. 1994: I PAC possono sopportare frammenti genomici piu piccoli (fino a Kb) Tappe 1998: Gli SNPs: nuova generazione di polimorfismi del DNA: sono sostituzioni di singole basi, con frequenza ogni poche centinaia di basi, sono stati individuati grazie all automazione del sequenziamento, permetteranno di generare mappe genetiche ad alta densita

17 by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione / identificare i geni e la loro funzione studiarne l evoluzione attraverso il confronto con altri genomi Studiare un genoma

18 by N.A. Analisi al computer A1 :Omologo animale mappato? A2 : Omologo animale clonato? A3 : Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1 :raccolta famiglie per mappatura C2 : delezioni o traslocazioni cromosomiche C5 : Raccolta pazienti non imparentati B1 :regione cromosomica candidata? B2 : Verifica nei database dei geni della regione B3 : Possibile gene candidato? B4 : e stato completamente caratterizzato? Informazioni di laboratorio D1 :mappatura genetica: ricerca genomica D2 : clonaggio dei punti di rottura D3 : nuovi geni umani identificati D4 : struttura genomica e sequenza completa D5 : Ricerca delle mutazioni E1 :trovata la localizzazione? E2 : errore nel tipo di eredita o eterogeneita genetica E3 : ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5 : trovate mutazioni patogene? TROVATO!!! SI NO SI NO SI NO Come identificare i geni

19 by N.A. Strategie * CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio sono note. Utile in pochi casi * CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. * STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia note STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu utilizzate, soprattutto per la possibilita di utilizzare le banche dati.

20 by N.A. Le strategie sono alternative, la scelta dipende dalle informazioni di partenza, ma ovviamente nel corso dello studio si integrano: praticamente alla fine si usano tutte. Non esiste quella giusta in assoluto esiste quella che mi puo dare maggiori risultati nelle condizioni sperimentali in cui mi trovo ad operare Attenzione

21 by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione / identificare i geni e la loro funzione studiarne l evoluzione attraverso il confronto con altri genomi Studiare un genoma Bisogna avere delle mappe collegate fra loro perche una sola non basta:

22 by N.A. Tipi di mappe: mappe fisiche * Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all altro sulla base della loro sequenza Se riesco ad allinearle con le mappe genetiche posso collegare un gruppo di cloni a un locus e cominciare a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: La sequenza clonata e il gene che sto cercando?

23 by N.A. Tipi di mappe: mappe genetiche Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo procedere, non si puo rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: La sequenza clonata e il gene che sto cercando?

24 by N.A. Tipi di mappe: mappe di espressione Mappe di espressione: ordinano all interno di una regione gli RNA espressi. Il DNA codificante costituisce una frazione del DNA di un organismo quindi e necessario collegare le mappe fisiche e genetiche a una mappa di espressione per evitare di concentrarsi su sequenze non idonee a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: La sequenza clonata e il gene che sto cercando?

25 by N.A. Le mappe fisiche Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: / mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, / mappe di restrizione a lungo raggio / mappe basate su cloni utilizzando STS e EST / mappe ottenute con FISH Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all altro sulla base della loro sequenza

26 by N.A. Le mappe fisiche Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: / mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all altro sulla base della loro sequenza Si originano dalla fusione in vitro del genoma di due specie e dalla susseguente origine di una linea cellulare che contiene nel suo nucleo i cromosomi della linea accetrice e alcuni cromosomi o parti di essi della donatrice

27 by N.A. Creazione degli ibridi somatici +PEG DonatriceAccettrice X X X X X X Ibrido Selezione.::. X X X X Sincarionte X X X X X X Eterocarionte binucleato X X X X X X

28 by N.A. STS RH Pannello di RH per il crom.5 caratterizzato con STS

29 by N.A. Tipi di mappe: mappe genetiche Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo procedere,

30 by N.A. Le mappe genetiche Si basano sugli studi di linkage cioe sull analisi della segregazione alla meiosi di marcatori genetici. Se due o piu marcatori vengono ereditati preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che mappino nella stessa regione genomica Ricordate? L unita di mappa e il centimorgan(cM): 1cM indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza pari a Si assume che 1cM sia pari a ~1.5Mb anche se la relazione diretta non c e : la mappa genetica puo essere piu lunga di quella fisica.

31 by N.A. Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti Linkage:fase di piu locus Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di linkage e a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione

32 by N.A. Polimorfismo * Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nellaspetto

33 by N.A. Polimorfismo * Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Polimorfismi proteici * Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR

34 by N.A. La connessione fra mappe Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problema e trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che un gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati. La mappa genetica me lo permetterebbe perche non riguarda specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza. Non posso pero studiare il gene candidato perche non ho la sequenza corrispondente. La possibilita di utilizzare STS e EST polimorfici ha permesso di risolvere il problema

35 by N.A. Gli STS: Sequence Target Site L automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per screenare con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui. Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro DNA genomico Clonaggio Sequenziamento GACTTAG CATAGCA ~300bp STS A,B,C.. scelta dei primers x A,B,C.. screening library con PCR A+,B-,C+.. A-,B+,C+.. B+,D+,G+ H+,F+,T-..F+,T-,Q+.. H F* Q A* C B* D G* mappa fisica:contiguo 1 2 A C B D G H F Q mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e F-A-G A C B D GH F Q I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi....

36 by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione / identificare i geni e la loro funzione studiarne l evoluzione attraverso il confronto con altri genomi Studiare un genoma

37 by N.A. Analisi al computer A1 :Omologo animale mappato? A2 : Omologo animale clonato? A3 : Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1 :raccolta famiglie per mappatura C2 : delezioni o traslocazioni cromosomiche C5 : Raccolta pazienti non imparentati B1 :regione cromosomica candidata? B2 : Verifica nei database dei geni della regione B3 : Possibile gene candidato? B4 : e stato completamente caratterizzato? Informazioni di laboratorio D1 :mappatura genetica: ricerca genomica D2 : clonaggio dei punti di rottura D3 : nuovi geni umani identificati D4 : struttura genomica e sequenza completa D5 : Ricerca delle mutazioni E1 :trovata la localizzazione? E2 : errore nel tipo di eredita o eterogeneita genetica E3 : ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5 : trovate mutazioni patogene? TROVATO!!! SI NO SI NO SI NO Come identificare i geni

38 by N.A. Strategie * CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio sono note. Utile in pochi casi * CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. * STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia note STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu utilizzate, soprattutto per la possibilita di utilizzare le banche dati.

39 by N.A. Richiamiamo un po di terminologia Genotipo: costituzione genetica di un individuo in relazione ad un particolare carattere Fenotipo: manifestazione fisica del carattere, non e necessariamente una patologia intesa in senso clinico La manifestazione fisica dipende dal metodo di rilevazione: es. anemia falciforme, thalassemia, emoglobinopatie E l operatore che sceglie il livello di indagine e definisce il fenotipo che vuole seguire: l individuo, gli organi, il tessuto, le cellule, il DNA... Locus : regione genomica dove mappa la sequenza di DNA coinvolta nella manifestazione del fenotipo. E individuato utilizzando tecniche laboratoristiche diverse: biochimiche, molecolari, citogenetiche

40 by N.A. Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti il gene mendeliano e un entita astratta identificata dalla modalita di segregazione e dalla mappatura in un LOCUS il gene molecolare e una sequenza codificante corrispondente ad un trascritto, che mappa nella regione identificata dal locus Gene e fenotipo

41 by N.A. Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti Prader-Willi/Angelmann, fenotipi autosomici dominanti : la mutazione piu frequente e la delezione di un segmento genomico che puo arrivare a 4Mb Gene e fenotipo Charcot Marie Tooth 1A, fenotipo autosomico dominante : la mutazione piu frequente e una duplicazione di un frammento genomico di 1.5Mb che comprende parecchi geni.

42 by N.A. Autosomico : locus che mappa su un autosoma Legato al sesso : locus che mappa sui cromosomi sessuali Omozigote: individuo in cui entrambi gli alleli sono uguali Richiamiamo un po di terminologia Alleli: forme alternative del locus che originano fenotipi distinguibili. Nella popolazione possono esistere n alleli, ma ogni individuo diploide ne possiede 2 degli n possibili. Gli alleli si originano per effetto delle mutazioni, e generano variabilita nella popolazione. Non e detto che ci sia un allele che genera fenotipo patologico. (gruppi sanguigni) Eterozigote: individuo in cui gli alleli di un locus sono differenti Ricordare che omozigote ed eterozigote non sono sinonimi di dominante e recessivo

43 by N.A. Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi Definizione classica SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA DI TRASMISSIONE E DIPENDONO DAL TIPO DI FENOTIPO CHE SI CONSIDERA: ANEMIA FALCIFORME: Recessivo se considero come fenotipo la presenza dell anemia: i portatori non hanno anemia Codominante se considero le catene dell emoglobina : sono presenti entrambe Se guardo la sequenza del DNA non e nell una nell altra, perche non sto guardando l espressione del prodotto

44 by N.A. Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi Definizione classica SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA DI TRASMISSIONE Da questo deriva che la terminologia A/a che correttamente si usa negli incroci quando si vuole indicare la relazione fra i prodotti degli alleli e una terminologia operativa: significa che il fenotipo originato da un allele non e evidenziabile se c e l allele A e quindi mi devo aspettare che soggetti con fenotipo A siano geneticamente Aa e questa informazione mi viene dall analisi degli alberi genealogici o dall incrocio Inoltre va ricordato che anche utilizzando A/a non vuol dire che a e derivato da A e costituisce un sottoprodotto di A. La terminologia che si deve usare al di fuori dello studio della trasmissione e : locus A alleli A 1,A 2, A 3, A n.. (locus white in Drosophila)

45 by N.A. SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA DI TRASMISSIONE SONO DOVUTI ALL INTERAZIONE DEL PRODOTTO DEI SINGOLI LOCUS CON L AMBIENTE, IL BACKGROUND GENETICO DEL SINGOLO INDIVIDUO E IL PERIODO DELLO SVILUPPO E DIFFERENZIAMENTO SI APPLICANO PERCIO ALLA POPOLAZIONE NON ALL INDIVIDUO LA GENETICA UMANA E FORSE L ULTIMA DISCIPLINA CHE VIENE APPLICATA AD UNA POPOLAZIONE NATURALE * A LIVELLO DI POPOLAZIONE MEGLIO PARLARE DI LOCUS: IL TERMINE GENE ASSUME SIGNIFICATI DIVERSI A SECONDA DEL TIPO DI INDAGINE Dominanza e recessivita

46 by N.A. Non si applicano al gene inteso come sequenza di DNA o locus. Dominanza e recessivita In alcune patologie (es.Fibrosi Cistica) gli affetti possono essere definiti eterozigoti composti: questo perche esistono mutazioni diverse che provocano la malattia. Di fatto gli affetti non hanno l allele normale, ma due alleli patologici. Geneticamente sono eterozigoti perche hanno due alleli diversi, ma dal punto di vista fenotipico sono indistinguibili dagli omozigoti. Il carattere e comunque recessivo Si puo continuare ad usare il termine dominante e recessivo, ma va tenuto ben presente il significato e soprattutto non va confuso con: dominante=+diffuso, recessivo=patologico, dominante=normale etc....

47 by N.A. Analisi al computer A1 :Omologo animale mappato? A2 : Omologo animale clonato? A3 : Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1 :raccolta famiglie per mappatura C2 : delezioni o traslocazioni cromosomiche C5 : Raccolta pazienti non imparentati B1 :regione cromosomica candidata? B2 : Verifica nei database dei geni della regione B3 : Possibile gene candidato? B4 : e stato completamente caratterizzato? Informazioni di laboratorio D1 :mappatura genetica: ricerca genomica D2 : clonaggio dei punti di rottura D3 : nuovi geni umani identificati D4 : struttura genomica e sequenza completa D5 : Ricerca delle mutazioni E1 :trovata la localizzazione? E2 : errore nel tipo di eredita o eterogeneita genetica E3 : ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5 : trovate mutazioni patogene? SI NO SI NO SI NO SI TROVATO!!! Clonaggio funzionale si parte da D3

48 by N.A. Clonaggio funzionale 2 Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa 2 Produzione di anticorpi specifici 2 Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione 2 Screening della library di espressione e isolamento della colonia 2 Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato 2 Sequenza dei cDNA cercando una ORF 2 Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni Albinismo: Tirosinasi EMOFILIA A: deficienza del fattore VIII FENILCHETONURIA: deficienza fenilalanina-idrossilasi

49 by N.A. Analisi al computer A1 :Omologo animale mappato? A2 : Omologo animale clonato? A3 : Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1 :raccolta famiglie per mappatura C2 : delezioni o traslocazioni cromosomiche C5 : Raccolta pazienti non imparentati B1 :regione cromosomica candidata? B2 : Verifica nei database dei geni della regione B3 : Possibile gene candidato? B4 : e stato completamente caratterizzato? Informazioni di laboratorio D1 :mappatura genetica: ricerca genomica D2 : clonaggio dei punti di rottura D3 : nuovi geni umani identificati D4 : struttura genomica e sequenza completa D5 : Ricerca delle mutazioni E1 :trovata la localizzazione? E2 : errore nel tipo di eredita o eterogeneita genetica E3 : ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5 : trovate mutazioni patogene? SI NO SI NO SI NO SI TROVATO!!! Clonaggio funzionale si parte da A1

50 by N.A. Variante: identificazione conoscendo la funzione normale Complementazione nel topo transgenico:il gene DFNB3 identificato grazie al gene di topo. Il topo shaker2 ha una patologia vestibolare che si riconosce perche gira su se stesso e scuote la testa. topo shaker2 topo sh2/sh2 Wild type X Mappato per linkage in 1cM del cromosoma11 di topo(17 umano) Si iniettano uova sh2/sh2 con BAC di topo wt. Wild type topo sh2/sh2 BAC### Si sequenzia il BAC murino e si cercano le mutazioni nei topi mutanti si identifica il gene e la sua funzione Si isola il BAC umano con primer esonici e si isola la sequenza umana, cercano le mutazioni nei pazienti

51 by N.A. Variante: identificazione conoscendo la funzione normale Isolamento di oncogeni attivati: cellule di topo vengono trasfettate con DNA derivato da un tumore umano, se crescono in maniera incontrollata vuol dire che contengono un oncogene Coltura di cellule NIH-3T3 di topo Alcune cellule sono trasformate Trasfezione di frammenti di DNA umano da tumore Selezione di una colonia trasformata ricerca sequenze Alu fagi che potrebbero contenere l oncogene

52 by N.A. CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. Si utilizza sempre meno Strategie

53 by N.A. *CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. 2 Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie 2 Screening della perdita di eterozigosi: utilizzata di solito per i tumori o quando vi sono indicazioni di delezioni 2 Anomalie cromosomiche: ricerca del coinvolgimento di una stessa regione in affetti con lo stesso fenotipo regione in affetti con lo stesso fenotipo Corea di Huntington, distrofia di Duchenne, fibrosi cistica, Corea di Huntington, distrofia di Duchenne, fibrosi cistica, neurofibromatosi, cancro colon-rettale….. Clonaggio posizionale

54 by N.A. Analisi al computer A1 :Omologo animale mappato? A2 : Omologo animale clonato? A3 : Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1 :raccolta famiglie per mappatura C2 : delezioni o traslocazioni cromosomiche C5 : Raccolta pazienti non imparentati B1 :regione cromosomica candidata? B2 : Verifica nei database dei geni della regione B3 : Possibile gene candidato? B4 : e stato completamente caratterizzato? Informazioni di laboratorio D1 :mappatura genetica: ricerca genomica D2 : clonaggio dei punti di rottura D3 : nuovi geni umani identificati D4 : struttura genomica e sequenza completa D5 : Ricerca delle mutazioni E1 :trovata la localizzazione? E2 : errore nel tipo di eredita o eterogeneita genetica E3 : ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5 : trovate mutazioni patogene? SI NO SI NO SI NO SI TROVATO!!! Clonaggio posizionale si parte da C1

55 by N.A. Analisi al computer A1 :Omologo animale mappato? A2 : Omologo animale clonato? A3 : Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1 :raccolta famiglie per mappatura C2 : delezioni o traslocazioni cromosomiche C5 : Raccolta pazienti non imparentati B1 :regione cromosomica candidata? B2 : Verifica nei database dei geni della regione B3 : Possibile gene candidato? B4 : e stato completamente caratterizzato? Informazioni di laboratorio D1 :mappatura genetica: ricerca genomica D2 : clonaggio dei punti di rottura D3 : nuovi geni umani identificati D4 : struttura genomica e sequenza completa D5 : Ricerca delle mutazioni E1 :trovata la localizzazione? E2 : errore nel tipo di eredita o eterogeneita genetica E3 : ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5 : trovate mutazioni patogene? TROVATO!!! SI NO SI NO SI NO Come identificare i geni

56 by N.A. Le alterazioni genetiche acquisite che portano alla trasformazione maligna sono un esempio di variazione genetica somatica (oltre al mosaicismo per i caratteri genetici nucleari e all eteroplasmia per le mutazioni mitocondriali). Il tumore ha un origine clonale, essendo il suo sviluppo innescato da un alterazione genetica in una singola cellula E l accumulo di alterazioni genetiche in una singola cellula che produce gli effetti fenotipici caratteristici del termine malignita. Cose il tumore

57 by N.A. I geni alterati nel cancro sono definiti oncogeni: questo nome deriva dalla scoperta di geni virali responsabili della trasformazione in tumore delle cellule infettate proto-oncogeni oncosoppressori I geni nei tumori caretaker (addetti alla manutenzione) landscapers (architetti del paesaggio) Gene Rb del retinoblastoma

58 by N.A. e un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi anni di vita puo essere monolaterale (solo un occhio colpito) o bilaterale (entrambi gli occhi) si puo manifestare in forme sporadiche o ereditarie diagnosticate a 7-10 anni, generalmente monofocali (solo in un punto dell occhio) diagnosticate nel primo anno di vita, multifocali (piu punti di un occhio) Retinoblastoma

59 by N.A. retinoblastoma bilaterale retinoblastoma monolaterale non-penetrante Apparente trasmissione dominante... Genetica del retinoblastoma

60 by N.A. Nel 1971 Alfred Knudson analizzo casi di bambini con retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale Osservo che: al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero sviluppato tumori bilaterali erano piu piccoli di quelli per i quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali; con l aumentare dell eta, la frequenza con cui venivano diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali aumentava molto piu lentamente. Alfred Knudson

61 by N.A. Knudson propose un modello (two-hit hypothesis) secondo il quale, affinche si abbia il retinoblastoma, e necessario che in una linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi mutazionali I evento ( hit )II evento ( hit ) I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale, pertanto, e presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e necessario un secondo evento perche si produca il tumore. Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio si realizza piu raramente, per cui l insorgenza e piu tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali.

62 by N.A. Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e stato fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali, concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita delezione 13q13-q14 L analisi cromosomica di questi pazienti ha dimostrato la presenza di una delezione del braccio lungo del cromosoma 13 di dimensione variabile ma con condivisione delle bande 13q13-q14: questa osservazione suggeriva che in tale regione si localizzasse un gene predisponente al retinoblastoma Il gene del retinoblastoma (Rb)

63 by N.A. Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del gene per l enzima esterasi D, enzima di funzione sconosciuta ma facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli, evidenziabile mediante elettroforesi di proteine. I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta della quantita normale di esterasi D ed esprimevano invariabilmente un solo allele. Rb ed esterasi L esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento ideale per studiare il gene del retinoblastoma

64 by N.A. L analisi di linkage esaminando la segregazione del polimorfismo dell esterasi D in famiglie con retinoblastoma ereditario e prive di delezione: gli alleli dell esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere retinoblastoma (lod score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente alla malattia fosse localizzato a livello della banda 13q14. Linkage di esterasi e Rb

65 by N.A. * Il secondo evento sarebbe consistito nella perdita della copia normale rimanente di questo gene... I tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti eterozigoti per il polimorfismo dell esterasi D e non portatori di delezione costituzionale del cromosoma 13. Verifica dellipotesi di Knudson Una mutazione in un gene del cromosoma 13 che costituirebbe al primo evento secondo l ipotesi di Knudson e presente nelle cellule normali dei portatori Per testare questa ipotesi si e usata nuovamente l esterasi D, espressa nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero espressi

66 by N.A. Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati ? il secondo evento consisteva probabilmente in una delezione che includeva i loci sia dell esterasi D che del retinoblastoma Per la verifica del secondo evento, si puo ricorrere a tecniche di biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la perdita di eterozigosita (LOH) Verifica dellipotesi di Knudson

67 by N.A. famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell esterasi D Perdita di eterozigosita LOH Cellule tumorali omozigoteeterozigote LOH

68 by N.A. La LOH si puo applicare sia ai tumori familiari che a quelli sporadici, suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che conducono allo sviluppo del tumore interessino un locus sul cromosoma 13. * Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto LOH Ce una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo stesso background genetico delle normali perche appartengono allo stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo tumorale, non alla variabilita genetica e questo permette di utilizzare anche gli sporadici

69 by N.A. * la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14 e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti affetti da retinoblastoma familiare * il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla regione 13q14 Clonaggio del gene del retinoblastoma

70 by N.A. * Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto diversi dal normale * pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti costituzionali..... Rb e un oncosoppressore Clonaggio del gene del retinoblastoma Ipotesi di Knudson confermata!

71 by N.A. In molti casi le mutazioni non consistono in delezioni o alterazioni a carico del gene tali da poter essere individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi piu difficili da evidenziare test molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per rivelarle Ricerca delle mutazioni

72 by N.A. Altri oncosoppressori

73 by N.A. Modalita di espressione Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche? Perche per manifestare il fenotipo e necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse) Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e sensibile alla quantita di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne pregiudica la funzione. Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e quello della cellula non dell individuo! Il tumore va considerato come un individuo : all interno dell organismo ci sono cloni ( individui ) che non manifestano il fenotipo perche hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l allele wild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore

74 by N.A.


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