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1 SPETTROSCOPIA NMR DI PROTEINE Struttura tridimensionale della proteina G con il metodo degli accoppiamenti dipolari Candidato: Francesco Stellato Relatore:

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1 1 SPETTROSCOPIA NMR DI PROTEINE Struttura tridimensionale della proteina G con il metodo degli accoppiamenti dipolari Candidato: Francesco Stellato Relatore: Prof. S. Morante (Dip.Fisica, Tor Vergata) Correlatore:Prof. M. Blackledge (IBS, Grenoble)

2 2 SOMMARIO Basi teoriche fisiche Apparato sperimentale Basi teoriche biologiche Preparazione del campione Simulazione Conclusioni

3 3 Basi teoriche fisiche Già nel 1946 Bloch 1 e Purcell 2, indipendentemente luno dallaltro, intuirono le potenzialità della Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). LNMR si basa sullinterazione tra il momento magnetico nucleare ed un campo magnetico esterno e può, quindi, essere utilizzato solo se J0. AZJ Pari 0 DispariIntero DispariPari/DispariSemi-intero A = numero di massa, Z = numero atomico 1 Bloch, Hansen, Packard. (1946), Phys.Rev. 69, p Purcell, Torrey, Pound. (1946), Phys. Rev. 69, pp

4 4 J 2 =J 2 = JJ = ħ 2 [J(J+1)] μ = γJ momento magnetico associato, γ = rapporto giromagnetico La degenerazione è rimossa in presenza di un campo magnetico esterno, B J z = ħm, m = (-J, -J+1,…, J-1, J) E m = -μB = - JB prendendo B // z B B 0 E m = - γJ z B 0 = -mħγB 0 2J+1 livelli equispaziati (livelli Zeeman)

5 5 Allequilibrio: stati popolati secondo la statistica di Boltzmann ħ= 1.05 x J·s; = 10 8 (T·s) -1 ; B= 10T; k B = 1.38 x J·K -1 T 300 K mħγB 0 /kT << 1 Per un campione macroscopico M=M 0 z ˆ

6 6 EQUAZIONI DI BLOCH dJ(t)/dt=M(t) x B(t); Poichè,M=γJ dM(t)/dt=M(t) x γB(t) Sistema di riferimento rotante intorno ad un asse fisso con velocità angolare costante, ω (dM(t)/dt) rot =(dM(t)/dt) lab +M(t) x ω= M(t)x(γB(t)+ω) Ponendo,B eff =B(t)+ω/γ Si ottiene,(dM(t)/dt) rot =M(t) x γB eff (t) M(t) precede intorno a B(t) con frequenza ω = γB; se B=(0,0,B 0 ) ω = ω 0 = γB 0 : M(t): campo magnetico variabile nel tempo f =-d /dt. f = segnale NMR

7 7 Allequilibrio: M//B Non cè segnale impulso rf M(t) precede intorno a B 0 cè segnale

8 8 A causa di fenomeni dissipativi (rilassamento) decadimento di: magnetizzazione trasversa (M x e M y ) e longitudinale (M z ) Bloch ha proposto semplici espressioni per descrivere il fenomeno del rilassamento: dM x (t)/dt=-M x (t)/T 2 M x (t)=M x (0)exp(-t/T 2 ) dM y (t)/dt=-M y (t)/T 2 M y (t)=M y (0)exp(-t/T 2 ), dM z (t)/dt=[M 0 -M z (t)]/T 1 M z (t)=M 0 -[M 0 -M z (0)]exp(-t/T 1 ) T 1 e T 2 : costanti di tempo longitudinale e trasversale

9 9 Apparato sperimentale 1.Magnete: solenoide super- conduttore; B > 10 T 2.Sonda (coassiale al magnete): invia limpulso rf e riceve il segnale 3.Programmatore di impulsi e trasmettitore: generano limpulso perturbante 4.Rivelatore: preamplificazione e conversione digitale 5.Computer: acquisizione dati e FT spettro NMR

10 10 Schema generale di un esperimento NMR 1.Il campione è posto in un campo magnetico B 2.Linvio di un impulso elettromagnetico perturba lequilibrio 3.La precessione della magnetizzazione genera un segnale elettrico noto come FID (Free Induction Decay) 4.Il FID è registrato, e quindi trasformato di Fourier, nel dominio della frequenza: FID(t) ( )

11 11 Basi teoriche biologiche Le proteine sono polimeri lineari di aminoacidi (aa) e svolgono la maggior parte delle funzioni necessarie alla vita (trasporto, catalisi, difesa immunitaria, etc…). I 20 diversi aa naturali differiscono per le caratteristiche fisico- chimiche della catena laterale R. Gli aa sono legati tramite il legame peptidico, che ha luogo tra il gruppo carbossilico di un aa ed il gruppo amminico del successivo, con la formazione di una molecola dacqua.

12 12 In una proteina sono individuabili 4 livelli strutturali: 1.Struttura primaria = sequenza lineare di aminoacidi 2.Struttura secondaria = struttura locale della catena ( -elica, - sheet, …) 3.Struttura terziaria = struttura 3D globale 4.Struttura quaternaria = disposizione spaziale di subunità diverse E utile definire 2 angoli torsionali: : rotazione intorno a C -N : rotazione intorno a C -C

13 13 Preparazione del campione 1.Selezione del gene che codifica la proteina 2.Inserimento del gene in un plasmide e trasferimento in batterio (E. coli) 3.Scelta del mezzo di crescita*: crescita a 37 °C* 4.Lisi e purificazione della proteina Caratteristiche necessarie: 1.Campione puro (almeno) al 95 % 2.Proteina stabile per tutta la durata dellesperimento 3.La proteina non deve formare aggregati alla concentrazione necessaria per lesperimento (generalmente, circa 1 mM)

14 14 15 NH 4 Cl (cloruro di ammonio) come unica fonte di N, per avere proteine marcate con 15 N 13 C 6 H 12 O 6 (glucosio) come unica fonte di C, per avere proteine marcate con 13 C 2 H 2 O (acqua pesante) per avere proteine marcate all80% con 2 H + C 6 2 H 12 O 6 (glucosio) per avere il 100% di 2 H

15 15 Simulazione Dati sperimentali RDC 3 InsightII * File PDB 2 Dati cristallografici 1 MECCANO 5 MODULE 4 RMS Σ[( (x 1 -x 2 ) 2 + (y 1 -y 2 ) 2 + (z 1 -z 2 ) 2 ] ½ / N *© Accelrys Inc.

16 16 Sito GB3 -elica -sheet1 -sheet2 -sheet3 -sheet4 La proteina G proteina della parete batterica con vari siti di legame per lanticorpo

17 17 HEADER IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN 05-AUG-94 XXXX TITLE THE THIRD IGG-BINDING DOMAIN FROM STREPTOCOCCAL PROTEIN G: TITLE 2 AN ANALYSIS BY X-RAY CRYSTALLOGRAPHY OF THE STRUCTURE TITLE 3 ALONE AND IN A COMPLEX WITH FAB COMPND PROTEIN G KEYWDS IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.P.DERRICK, D.B.WIGLEY ATOM 1 N MET A N ATOM 2 CA MET A C ATOM 3 C MET A C ATOM 4 O MET A O ATOM 5 CB MET A C ATOM 6 CG MET A C ATOM 7 SD MET A S ATOM 8 CE MET A C ATOM 9 N THR A N ATOM 10 CA THR A C ATOM 11 C THR A C ATOM 12 O THR A O

18 18 RDC: Accoppiamento dipolare per un sistema di 2 nuclei, A e B : media temporale o sullensemble ( solvente anisotropo) : angolo AB, B; D AB =- 0 (h/2π)γ A γ B /(4π 2 r 3 ) D AB può essere data in funzione di e di una matrice diagonale, A, (tensore di allineamento). Gli elementi A ii corrispondono alla probabilità di trovare li-esimo asse parallelo a B 0.

19 19 Sono stati misurati (Ulmer 3 ) 6 campioni (A-F) di proteina G da E.coli HMS174 in mezzo minimo di crescita: 13 C 6 H 12 O 6 e 15 NH 4 Cl e con diversi solventi 4 valori di RDC per residuo: C α -C, C α -H α, N-H, C-N MODULE 4 RDC sperimentali A RDC calcolati 3 T.S. Ulmer, B.E.Ramirez, F.Delaglio, A.Bax. (2003), JACS 125: pp MODULE By P.Dosset, J.C.Hus, M.Blackledge. IBS, Grenoble

20 20 MECCANO RDC in 2 mezzi PDB φ e ψ (se disponibili) A ii nei 2mezzi Procedura step-by-step: dal 1° peptide determinando lorientazione relativa di quelli seguenti per cui è minima. 5 MECCANO By M.Blackledge. IBS, Grenoble

21 21 ResiduiRMS 1 (Å)RMS 2 (Å)RMS 3 (Å)RMS 4 (Å)RMS 5 (Å)RMS 6 (Å)RMS 7 (Å) RMS 1 : -elica; RMS 2 : intera struttura; RMS 3 : vincolo su e ( =10°); RMS 4 : vincolo su e ( =0.001°); RMS 5 : come RMS 3 tranne tra dove come RMS 4 ; RMS 6 : come RMS 1 ; RMS 7 : come RMS 4 La simulazione è stata eseguita utilizzando i seguenti campioni: peg: polietilen glicolo; npg: gel di poliacrilamide carico negativamente ppg: gel di poliacrilamide carico positivamente In particolare: da 1 a 5 è stata usata la coppia npg-ppg (A npg · A ppg = ), per 6 e 7 la coppia npg-peg (A npg · A peg = 0.224)

22 22 Conclusioni LNMR è una tecnica molto potente per lo studio della struttura delle molecole in soluzione. La ricerca di strategie sempre più efficienti per estrarre informazione dagli spettri è di importanza fondamentale. Luso degli RDC come unico mezzo per determinare la struttura 3D va proprio in questa direzione, e il lavoro di simulazione qui presentato ne ha dimostrato le potenzialità nel caso specifico di una proteina strutturalmente rappresentativa.

23 23 Interpretazione dei risultati delle simulazioni RMS 1 :il risultato è buono solo nella parte di elica, che è la parte usata per trovare il tensore di allineamento. RMS 2 : il risultato è buono anche tra 8 e 41, mentre nella parte finale persistono problemi. RMS 3 :il risultato è migliore di quello ottenuto senza questi vincoli, ma nella parte finale persistono problemi. RMS 4 : il risultato è buono ovunque. RMS 5 : Per i residui 6-41 si ottiene come aspettato un RMS simile a quello di RMS 3 mentre lRMS dellintera proteina è sensibilmente migliore. RMS 6 e RMS 7 : Quanto più piccolo è A a · A b tanto migliore è la determinazione della struttura 3D.

24 24 NucleoJ (T·s) -1 % 1H1H½2.67· H2H14.11· C½6.73· N11.93· N½2.71· O5/2-3.63· F½2.51· Proprietà di nuclei leggeri con J 0

25 25 V = - V 0 + ½ k r 2 – V ls l s – V l l(l+1) Modello a strati Livelli a particella singola


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