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Farmaci Biotecnologici Mariapia Vairetti Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Sezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare.

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Presentazione sul tema: "Farmaci Biotecnologici Mariapia Vairetti Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Sezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare."— Transcript della presentazione:

1 Farmaci Biotecnologici Mariapia Vairetti Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Sezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare

2 Cosa sono? 1953: La scoperta del DNA Università della California: nasce la tecnologia del DNA ricombinante!

3 Tecnica del DNA ricombinante Tecnica del DNA ricombinante: inserire un segmento di DNA all'interno di un organismo ospite, permettendo la combinazione di geni provenienti da specie molto distanti tra loro: Inserimento di un gene dinteresse (es. gene umano che codifica per la proteina da produrre come farmaco), in un organismo ospite, fatto poi crescere in un fermentatore industriale per produrre la proteina

4 Cosè unfarmaco biotecnologico? Farmaco progettato mediante la tecnologia del DNA ricombinante. Farmaco di sintesi per cui sono usate pratiche biotech nella fase di progettazione o di valutazione

5 Farmaci biotecnologici Il primo farmaco ottenuto ingegnerizzando un sistema vivente (batterico) è stato l'insulina, approvato dalla FDA nel Anche l'ormone della crescita umano, precedentemente estratto dai cadaveri, fu rapidamente ingegnerizzato. Nel 1986 la FDA approvò il primo vaccino umano, contro l'epatite B. La struttura dell'Insulina rosso:carbonio, verde:ossigeno; blu:azoto; rosa:zolfo La produzione industriale di farmaci utilizzando i sistemi viventi come bioreattori si è da allora largamente diffusa, diventando attualmente la via preferita di sintesi di numerosi farmaci, in particolare per il costo di produzione relativamente basso.

6 Interferone beta: peso molecolare Aspirina: Peso molecolare 180 ChimiciBiotecnologici I medicinali biotecnologici sono più grandi e complessi di quelli chimici

7 Produzione Costi di produzioneCosti di produzione Costo di uno stabilimento di produzione per biofarmaceutici è maggiore di uno stabilimento tradizionale (da 200 a 400 milioni $) Pochi siti produttivi vs i molti dei prodotti tradizionali Metodi di produzioneMetodi di produzione Eventuale interferenza con la conformazione finale della molecola. Diverso profilo di sicurezza: anche piccole variazioni nei processi produttivi possono influenzare la sicurezza e lefficacia del farmaco

8 Farmaco-tossicologia Biotech Problemi negli studi di assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione Specie animali con sensitività simile agli umani Reazioni Immunologiche negli animali

9 Clinica – Prodotti classici Fase I - Studi iniziali effettuati su volontari sani per determinare il metabolismo e le azioni farmacologiche del farmaco sull'uomo, la sicurezza e gli effetti collaterali a diversi dosaggi. Questi studi possono essere compiuti anche su pazienti per ottenere informazioni molto preliminari sulla possibile efficacia della terapia (Fase I-II). Il numero di soggetti studiati non supera gli 80. Fase II - Studi su pazienti per esplorare l'efficacia del farmaco spesso attraverso il confronto fra un gruppo di pazienti che riceve il trattamento ed un gruppo di controllo che riceve placebo. Anche in questi studi si valutano la sicurezza e gli effetti collaterali. Il numero di soggetti studiati non supera i 300. Fase III - Studi su pazienti per una valutazione definitiva del rapporto rischi/benefici ai fini della registrazione del composto come farmaco. Il numero di soggetti studiati non supera i 3000.

10 Clinica- Biotecnologici Esperimenti sugli animali meno predittivi Dose-risposta specifica: non lineare, a campana, Studi di dose escalation più approfonditi Reazioni immunologiche es: TNG 1412

11 Biotech: il mercato globale 63 Miliardi $ (2005) Vendite raddoppiate dal 2000 al 2004 Al momento più di 190 farmaci biotecnologici sono sul mercato (20% del totale) e sono stati assunti da 325 milioni di pazienti Circa il 40% delle molecole in sperimentazione clinica sono derivanti dalle biotecnologie

12 Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici Le tecniche di ingegneria genetica non sono prive di rischi e pertanto devono essere utilizzate con cautela. Per evitare che dai risultati di queste manipolazioni si producano effetti indesiderati o imprevisti, gli esperimenti sul DNA ricombinante sono sottoposti a regole e a controlli molto severi. Limportanza assunta dai farmaci biotecnologici è comunque ormai dimostrata dal fatto che a livello mondiale questi prodotti rappresentano circa il 20% di tutti i nuovi farmaci convenzionali approvati ogni anno.

13 Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici. Considerando che nel 2001 più di 200 proteine ricombinanti risultavano in fase di sperimentazione clinica nelluomo è prevedibile che nei prossimi anni i nuovi farmaci biotecnologici continueranno a rappresentare una percentuale significativa di tutti i nuovi farmaci che saranno immessi nel mercato. Pertanto la portata di questa metodica è enorme. La possibilità di copiare con la massima precisione sostanze prodotte fisiologicamente allarga enormemente la possibilità di intervento del medico. Se da una parte l'impiego del Dna ricombinante consente di creare nuovi farmaci, dall'altra può ottimizzare i farmaci già noti, ad esempio rendendo più facile la loro assunzione.

14 Sul Journal of Natural Products dove è stato pubblicato questo studio si legge: "l'avvento di nuove tecniche di chimica combinatoria negli anni '90 ha spinto molte industrie farmaceutiche a cambiare metodo di ricerca". Quindi i chimici hanno cercato la loro ispirazione per produrre nuovi farmaci nei loro computer. Il risultato di ciò, spiega Newman, è che ci sono sempre meno farmaci innovativi. Nel 2004 hanno concluso tutti i test e sono giunti in commercio solo 25 nuovi farmaci. David Newman, direttore del dipartimento Prodotti naturali del National Cancer Institute americano. Dal 1981 ad oggi il 73% di tutti i nuovi farmaci messi in commercio nascono direttamente o indirettamente (tramite ottimizzazioni in laboratorio) da vegetali, animali e invertebrati marini. E questo nonostante i sempre maggiori investimenti in campi come le biotecnologie. Svantaggi delle biotecnologie

15 Ricerche in Biotecnologia La maggior parte delle ricerche sono volte alla produzione di proteine o peptidi per scopi terapeutici: Ormoni polipetidici Prodotti del sangue (coagulanti e trombolitici) Farmaci antinfettivi e antitumorali Immunomodulatori e vaccini

16 Prodotti Terapeutici La maggior parte di farmaci proteici era disponibile in quantità limitate Prodotti ottenuti per estrazione dal sangue o tessuti e organi delluomo o di animali con rischio di trasmissione di malattie infettive

17 Insulina umana il primo prodotto ricombinante autorizzato per uso terapeutico

18 INSULINA Linsulina è prodotta dalle cellule delle isole pancreatiche sotto forma di un precursore di 110 aminoacidi detto preproinsulina La conversione della proinsulina in insulina avviene nel complesso di Golgi ad opera di endopeptidasi.

19 Effetti immediati e ritardati dellinsulina 1. Favorisce lentrata di glucosio nelle cellule 2. Nel fegato: - favorisce la sintesi di glicogeno (utilizzo del glucosio) - inibisce la glicogenolisi (deg. glicogeno) - inibisce la gluconeogenesi 3. Nei muscoli: - promuove la sintesi proteica e inibisce il catabolismo proteico - promuove la sintesi di glicogeno 4. Nel tessuto adiposo: - aumenta la sintesi di acidi grassi e trigliceridi, riduce la lipolisi inattivando le lipasi

20 Meccanismo dazione dellInsulina In seguito al legame con linsulina il recettore viene subito internelizzato, in seguito ad internelizzazione il recettore può essere degradato o riciclato per tornare sulla superficie della cellula. Il legame dellinsulina al recettore porta ad una rapida autofosforilazione dei residui di tirosina, questo catalizza la fosforilazione di altri substrati enzimatici. Linsulina può anche controllare la sintesi di secondi messaggeri, tramite lattivazione della fosfolipasi C che possono mediare lazione di enzimi cellulari.

21 Profilo fisiologico dellinsulina Produzione: 0,6 U/kg/24h - produzione basale continua, indipendente dai pasti - secrezione episodica e rapida, in corrispondenza dei pasti Ore della giornata Glucosio plasmatico mmol/l Soggetto normale Soggetto diabetico Pasti

22 Deficit di insulina: Diabete Mellito eccesso extracellulare deficit intracellulare glucosio fame in mezzo allabbondanza Si tratta della principale patologia che interessa il pancreas endocrino. Causa alterazioni del metabolismo ed iperglicemia entrata di glucosio nelle cellule di glucosio in circolo: gluconeogenesi epatica

23 Diabete Mellito DIABETE DI TIPO I o INSULINO-DIPENDENTE Compare soprattutto nei giovani Insulina virtualmente assente Causa chetosi Sembra avere cause autoimmuni Si tratta con insulina esogena DIABETE DI TIPO II o INSULINO-INDIPENDENTE Compare soprattutto negli adulti obesi Carenza recettori insulina Non causa chetosi Sembra avere cause ereditarie Può essere tenuto sotto controllo con una dieta adeguata ed esercizio fisico Si tratta con antidiabetici orali (sulfaniluree)

24 Analoghi dellinsulina Sono prodotti in cui la sequenza aminoacidica propria dellinsulina umana viene modificata ad arte con delle sostituzioni di uno o più aminoacidi Insulina Lispro Azione rapida (< 30 minuti) Durata breve (3 ore)

25 Analoghi dellinsulina Insulina Lispro Tempo (minuti) Insulina Lispro Insulina Umana Normale Concentrazione di insulina libera nel sangue (µg/L) Somministrazione al momento del pasto (IR: 30 minuti prima) Somministrazione dopo il pasto nei bambini molto piccoli Minor accumulo sottocutaneo: minor rotazione delle sedi diniezione Poiché lazione termina dopo circa 4 ore è necessario associarla ad uninsulina a lunga durata, per il mantenimento dei livelli basali

26 Analoghi dellinsulina Insulina Aspart Azione rapida ( 60 minuti) Durata breve (3 ore) Carica -

27 Concentrazione plasmatica doppia in metà tempo rispetto a IR Necessario associare uninsulina ad azione ritardata per il controllo della glicemia notturna Analoghi dellinsulina Insulina Aspart Tempo (minuti) Insulina Aspart Insulina Umana Normale Concentrazione di insulina libera nel sangue (µg/L)

28 Asp Analoghi dellinsulina Insulina Glargina Cariche + Lunga durata dazione ( 24 ore) Tempo di inizio ( 1.5 ore)

29 Analoghi dellinsulina Insulina Glargina Assenza del picco dazione Simula il profilo di secrezione continua di insulina dei soggetti non diabetici Somministrazione 1 sola volta al giorno Poiché formulata in soluzioni a pH acido non la si può somministrare insieme ad altra insuline (pH neutro) Tempo (ore) dopo liniezione sottocute Utilizzazione del Glucosio (mg/kg · min) Insulina Glargina Insulina 24 Termine dellosservazione

30 Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Ormoni Polipeptidici Eritropoietina: regola la produzione di globuli rossi da parte del midollo osseo Epocim ® Peptidi o piccole proteine che svolgono funzioni essenziali nel controllo del metabolismo nei mammiferi. Alcuni sono farmaci salvavita Ormone della crescita: Humatrope ®

31 Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Proteine del sangue Fattore VIII: Recombinate ® Proteine o fattori coinvolti nei processi della coagulazione del sangue (fattori VII, VIII, IX) sia nei processi che degradano i coaguli (TPA) Si sono eliminati i rischi associati alla potenziale contaminazione da parte di agenti virali (HIV, HBV, HCV) TPA: Activase ®

32 Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Immunomodulatori e Antitumorali Interferone : usato nel trattamento della SM, agisce sui linfociti T inibendone la migrazione e riduce la produzione di citochine. Avonex ®, Betaferon ®, Rebif ® I più noti sono gli interferoni che a seconda del tipo possono esplicare attività antivirale ( e ), immunomodulatrice ( ) o antitumorale ( ). Interferone : usato nel trattamento di cancro al rene, melanoma, alcune forme di linfoma e leucemie. IntronA ®, Infergen ®, Alfaferone ®, Roferon-A ® Interferone : usato per ridurre lincidenza di infezioni in pazienti con ridotte difese immunitarie. Imukin ®

33 Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Immunomodulatori e Antitumorali Antagonisti del TNF: usati nel trattamento dellartrite reumatoide e psoriasica. Enbrel ®, Remicade ®, Altre molecole che trovano applicazione nella terapia antitumorale sono le interleuchine (IL-2), antagonisti del TNF IL-2: usata nel trattamento di alcune forme tumorali come il cancro al rene e alcuni melanomi. Proleukin ®

34 I risultati dei farmaci biotecnologici: anticorpi nella antitumorale Circa il 30% delle pazienti con tumore mammario, produce un'elevata quantità di una proteina, chiamata HER2, fondamentale per la crescita del tumore. Contro l'HER2 è stato messo a punto un farmaco, il trastuzumab, anticorpo monoclonale impiegato con successo negli anni passati per trattare il tumore mammario metastatico. Scarsi gli effetti collaterali con l'eccezione di un certo grado di cardiotossicità in meno del 4-5% delle pazienti trattate. L'anticorpo monoclonale è stato utilizzato associato alla chemioterapia, nei tumori del seno in fase iniziale, subito dopo il trattamento chirurgico. Il trastuzumab ha ridotto il rischio di ricaduta del 50%. La sopravvivenza libera da malattia a 4 anni nelle pazienti trattate con sola chemioterapia è stata del 67%, mentre in quelle trattate con chemioterapia più trastuzumab è stata dell' 85%.

35 Vaccini I vaccini classici: - microrganismi uccisi (trattamento fisico o chimico) - microrganismi vivi attenuati - tossoide - coniugati secondo i principi di Jenner e Pasteur 1995: sequenziato il genoma del primo patogeno (H. influenzae)

36 Mediante la tecnica del DNA ricombinante sono stati prodotti diversi vaccini la maggior parte dei quali è stata allestita clonando in una cellula procariota o eucariota il gene del microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena, cioè quella proteina che nellospite porta alla produzione di anticorpi in grande quantità. Vaccini Ricombinanti Vaccini a sub-unità Vaccini virali: una proteina del capside o della membrana esterna (envelope) Vaccini batterici: proteine di adesione (antigeni delle fimbrie) o specifiche tossine modificate (anatossine)

37 Vaccino contro lEpatite B: 1° Vaccino Ricombinante Autorizzato Epatite B rappresenta un grosso problema sanitario: il virus responsabile (HBV), oltre che a causare la cirrosi epatica è anche un agente cancerogeno (cancro al fegato). Ad oggi il numero dei portatori cronici è stimati sui 300 milioni e possono trasmettere il virus a coloro che vengano in contatto con sangue infetto, liquido seminale, secrezioni vaginali, saliva, sudore o lacrime perpetuando così il mantenimento dellinfezione.

38 Vaccino contro lEpatite B: 1° Vaccino Ricombinante Autorizzato Virus a DNA con envelope Il virione contiene due antigeni associati al guscio proteico interno (core): Hbc e Hbe e un antigene di superficie (sullenvelope) HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) HBsAg rappresenta quindi la molecola di scelta per allestire il vaccino.

39 Vaccino contro lEpatite B: 1° Vaccino Ricombinante Autorizzato Il gene virale che codifica per HBsAg è stato clonato in un vettore e quindi trasferito ed espresso in un lievito S. Cerevisiae Lantigene prodotto dal lievito presenta tutte le caratteristiche della proteina HBsAg nativa (glicosilazione e altre modifiche post- traduzionali) Antigene viene purificato per ultracentrifugazione, cromatografia e precipitazioni frazionate (purezza > 98%) viene adsorbito su Al(OH) 3 che funziona da adiuvante Engerix-B ®

40 Vaccino contro la Meningite Batterica Il maggior responsabile di questa patologia è il batterio Haemophilus Influenzae di tipo b (Hib). Prima della diffusione del vaccino la Meningite Batterica colpiva negli Stati Uniti 1 bambino su 200 1/4 dei bambini che sopravvivevano allinfezione presentavano lesioni cerebrali o perdita delludito Oggi, grazie al vaccino ricombinante la meningite da Hib è una rarità: lincidenza di infezione si è ridotta del 90% ed in alcuni paesi è addirittura scomparsa Hiberix ®

41 Produzione di tossine batteriche modificate, da parte dello stesso ceppo patogeno, dopo mutazione genetica Mediante la tecnica del DNA ricombinante è stato ottenuto un ceppo di Bordetella Pertussis capace di produrre una tossina della pertosse del tutto identica, antigenicamente, a quella del ceppo patogeno, ma assolutamente priva di tossicità. La tossina mutata, prodotta in laboratorio su larga scala, viene purificata e impiegata come vaccino Vaccino Antipertosse

42 Vaccini vivi ricombinanti Batteri o virus modificati geneticamente in modo da poter essere impiegati come vaccini vivi ricombinanti

43 Vaccini vivi ricombinanti Nuovi vaccini: si sono incorporati i geni di alcuni virus (Epatite B, H. Simplex, Influenza Virus) nel genoma del Vaccinia Virus Nel coniglio, esperimenti preliminari di vaccinazione hanno dimostrato che si ottiene protezione valida verso questi virus La scelta di questo virus vettore sta nella sua resistenza: un vaccino così allestito non deve essere refrigerato e può venire liofilizzato e somministrato mediante scarificazione cutanea Microrganismi eterologhi naturalmente non patogeni o resi tali Alcuni proxivirus e batteri del genere Salmonella ed Escherichia Dopo ingegnerizzazione fungono da vettori di geni esogeni, esprimono cioè le proteine immunogene dellagente patogeno verso cui si vuole proteggere lindividuo

44 Vaccini vivi ricombinanti In questi microrganismi sono stati modificati o deleti i geni che ne condizionano la virulenza Il microrganismo potrà moltiplicarsi nel soggetto vaccinato, stimolando attivamente la risposta immunitaria specifica senza però causare la malattia Virus Erpetico allo studio quale vaccino dopo delezione del gene TK che causa la virulenza Batterio Vibrio Cholerae allo studio quale vaccino dopo averlo privato della capacità di produrre lenterotossina attiva, ma ancora in grado di indurre immunità Ceppi di microrganismi patogeni omologhi

45 Dove è concentrata la ricerca biotech nel mondo Source: PLG Italy – Convegno Novara – Intervento G. Corsico - modificata


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