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RNA interference. phenotype Forward genetics Reverse genetics Ricombinazione omologa in cellule embrionali staminali di topo: topi KO RNA antisenso RNA.

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Presentazione sul tema: "RNA interference. phenotype Forward genetics Reverse genetics Ricombinazione omologa in cellule embrionali staminali di topo: topi KO RNA antisenso RNA."— Transcript della presentazione:

1 RNA interference

2 phenotype Forward genetics Reverse genetics Ricombinazione omologa in cellule embrionali staminali di topo: topi KO RNA antisenso RNA interference

3 RNA interference: Introduzione nella cellula di RNA a doppio filamento induce il silenziamento del gene target Esempio di Silenziamento Genico Post Trascrizionale (PTGS): Già noto nelle piante: transgeni ad alto numero di copie e altamente trascritti inducono il silenziamento del gene endogeno Può essere considerato come un primitivo sistema di autodifesa contro RNA esogeno (virus) o RNA endogeno trascritto in modo aberrante (trasposoni) Un nuovo potente strumento di modulazione dellespressione genica Nuove e inattese rivelazione sui meccanismi di regolazione genica fliesfungiwormsmammalsplants

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5 La Scoperta dell RNAi Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Fire et al, 1998 In C. elegans: introduzione di dsRNA è molto più potente nellindurre il silenziamento genico rispetto a sRNA e asRNA dsRNA corripsondenti a regioni introniche o al promotore non funzionano dsRNA microiniettato nelle gonadi induce silenziamento genico in tessuti mitotici: amplification-spreading In Drosophila: Un estratto citoplasmatico di Drosophila + luciferasi mRNA esogeno + dsRNA luciferasi: silenziamento genico dsRNA guida la formazione di un complesso citoplasmatico che determina la degradazione specifica di mRNA omologo RNA interfernce is mediated by 21 and 22-nucleotide RNAs Elbashir et al, 2001 Targeted mRNA degradation by double stranded RNA in vitro Tuschl et al, 1999 In Drosophila: dsRNA è processato a 21-22nt dsRNA con 5P, 2nt protruding dsRNA sono sufficienti a indurre RNAi

6 Produzione di siRNA dsRNA, 5 P, 2nt overhang Riconoscimento e taglio endonucleasico del mRNA target DICER: RNAse III ribonuclease family specifico per dsRNA Altamente conservato in flies, plants, worms e human RISC-RNA Induced Silencing Complex Endonuclease non identificata: SLICER Copurifica con ARGONAUTE e EIFC2 (elongation factor) e elicasi DICER RISC

7 I vermi sono diversi… In C. elegans SPREADING:dsRNA microiniettato nelle gonadi causa RNAi in tessuti mitotici nel resto dellorganismo AMPLIFICATION: RNAi efficiente anche a partire da quantità minimi di dsRNA TRANSITIVE RNAi: il silenziamento genico può agire in TRANS e in CIS. Movimento 3 -5 dellattività nucleasica e generazione di nuovi dsRNA RdRP: RNA polimerasi RNA dipendente Sid1: canale di membrana

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9 Un ruolo biologico per lRNAi? RNAi: Un primitivo sistema immunitario contro virus e retrotrasposons Inattivazione dellRNAi causa diffetti nello sviluppo in diversi organismi Mutationi in ARGONAUTE (dsRNAbinder in RISC) causano diffetti nello sviluppo in A. thaliana, C. elegans e Drosophila microRNA piccoli (21-22nt) ssRNA scoperti in C.elegans (Lin4 and Let7: worms development) Altamente conservati nellevoluzione Silenziamento genico a livello postraduzionale: mRNA binding-blocco sintesi proteica nt single strand RNA processati da dsRNA precursori a 70nt (miRNA)!! Link to RNAi: DICER ko hanno alti livelli miRNA precursoridi Lin4 e Let7 RISC DICER

10 Non solo mRNA….Chromatin remodelling!

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12 Geni non codificanti nelluomo? mRNA tRNA ncRNA snRNA: spliceosome snoRNA: rRNA-tRNA-snRNA modifications rRNA GENE PROTEINA Cis-AS-RNA:XIST miRNA asRNA

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14 NB: computationl tools developed on the basis of known miRNA seq identified 255 putative human miRNA encoding genes! miRNA nelluomo miR181 is a hematopoietic specific miRNA that drive differentiation of stem cell to the Blineage 52% of analized miRNA map to genomic site involved in cancer

15 mRNA Antisenso nelluomo

16 RNAi un nuovo strumento per lo studio della funzione genica nei mammiferi Major limitation long dsRNA >30nt is effective in mammals, but induce many protective pathway Long dsRNA trigger PKR IFNRNAseL apoptosisdsRNA degradation Block of protein synthesis Phosp of ElF2a

17 Elbashir, S. M. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (2001). 2nt increase stability easier synthesis Source for siRNA: Dharmacon MWG Ambion

18 siRNA transfection TRANSIENT: siRNA are stable, Rate of cell growth Dilution Protein half-life EFFICIENCY OF TRANSFECTION: Some cells are refractory to transfection Electroporation leads to cell death COST: siRNA are chemically sinthetized, therefore very expensive AND NOT RENEWABLE…. Use in vivo????? siRNA is transfection is very efficient in most cell lines siRNA silencing is immediate PRO CONTRO Vettori a DNA per RNAi ?

19 promoteri RNA polIII: U6 e H1 sintesi di short hairpin RNA (shRNA) e siRNA in vivo Nessuna sequenza richiesta dopo start site per la trascrizione TTTT: sufficiente per terminazione More efficiently processed by DICER!! DNA mediated RNAi. H1/U6 clonati in vettori plasmidici VIRUS vector mediated RNAi:H1/U6 clonati in vettori retrovirali: lintegrazione stabile nel genoma oncoretrovirus MoMuLV or MSCV silenziamento del provirus durante lo sviluppo le cellule devono essere nel ciclo cellulare per poter essere infettate lentivirus HIV-1 nessun silenziamento: Topi transgenici infettano cellule quiescenti (cellule staminali….) PRO Cheap Stable clones for long term experiments Long half life protein targeted CONTRO Interference require trasncription: timing…. Transfection is less efficient

20 Plasmid vector

21 retroviral vector RAS (GTP binding protein): tra gli oncogeni più frequentemente mutati nei tumori umani (30-50%) (RAS-v12: Attivazione costituiva nello stato legato a GTP) Proliferazione, differenziamento, migrazione e sopravvivenza cellulare. wtRAS è essenziale per la sopravvivenza della cellula Growth signalRAS proliferazione

22 H1 promotercloned in ppMSCV puro retroviral vector:pRETROsuper Stably integrates in cell genome retroviral vector

23 siRNA nel trattamento dei tumori umani: Terapia anticancro: Nessuna tecnologia è in grado di colpire esclusivamente lespressione di un oncogeno mutante attivato

24 tetOFF/ON H1 and U6 promoter system Limitazioni dellRNAi stabile: impossibile studiare geni essenziali per sopravvivenza cellulare (housekeeping) e sviluppo Sviluppo di nuovi vettori per lespressione condizionale-inducibile dei shRNA tossicità background

25 Disegnare lsiRNA perfetto 1) stability of the hairpin 2) access to RISC 9nt loop 2nt TT overhang Low GC content Empirical observation Structure of miRNA

26 Mittal, Nature Review Gentic, 2004 Regole per la produzione di siRNA 29 su 30 dsRNA inducono più 50% silencing su 6 geni target

27 Specificità…? SI NO siRNA against endogenous GFP expression didnt affecct any other gene siRNA against endogenous gene can affect other genes with weak sequence similarity Use indipendent siRNA against same target Rescue the observed Loss of Funtion phenotype by expressing the target gene with a silent mutation in the target region

28 High-throughput functional screenings

29 Genomewide screenings for critical players in human cancer normal cellcancer cell Genetic lesions Attivazione di ONCOGENi Inattivazione di TUMOR SUPPRESSOR controlled growthuncontrolled growth

30 Tumori diversi hanno caratteristiche comuni Hannan and Weinberg, 2000 p53 pRb Tumor suppressors

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33 Target mRNA Overspressione di un oncogene Silenziamento di un TS Possibile ruolo dei miRNA nei tumori umani

34 Normal cell + siRNA library Cancer cell + siRNA Identificazione di nuovi oncogeni o TS Tumor phenotype reversion of tumor phenotype RNAi silenzia un Tumor suppressor RNAi silenzia un oncogene

35 ? Genome wide functional screenings Sequenziamento del genoma umano Annotazione di tutte le possibili ORF Costruzione di siRNA contro tutti i geni umani

36 Loss of funtion screenings by RNAi

37 Infect cells with siRNA library Phenotype of interest The targeted gene is required for the phenotype How can we identify the targeted gene? PCR with primer flanking the siRNA encoding DNA sequnece cloningsequencing

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39 CELL SYSTEM Primary Human fibroblast (BJ) infected with temperature sensitive LargeT from SV40: ASSAY Colony formation: primary cells plated at low density undergo growth arrest and senescence Human fibroblast (BJ)+ts largeT

40 PCR with primer flanking the siRNA oncoding DNA sequence cloning sequencing single clone isolation shRNA library: 7914 genes Cell-cycle Transcription Signal transduction Methabolism Genes involved in cancer To increase knockdown : 3 shRNA/gene 70%inhibition for 70% of the genes RPS6KA6, HTATIP, HDAC4, CCT2, KIAA0828

41 THE EFFECT IS GENE SPECIFIC

42 THE targeted GENES ARE IN THE p53 PATHWAY IONIZING RADIATION U2OS: osteosarcoma cells

43 p21bax Identified genes affect the expression of a p53 target gene

44 Limitations: single clone isolation re-cloning and retesting siRNA BAR-CODE screens Relative abundance of BARCODE in a cell population reflect the effect of the knockdown on cell viability Infect cells Single cell derived clones PCR of hairpin sequence Re-Cloning and sequencing Test again select phenotype Fluorescent labeling Hybridize to DNA Microarray containing hairpin sequences from library Identification of highly represented shRNA Infect cells select population with phenotype Stably integraetd vectors introduce a molecular fingerprint in the infected cell: The 19 hairpin sequence is gene specific and behave as a MOLECULAR BARCODE

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46 Silenziamento genico specifico, efficiente e stabile nel tempo (economico e veloce). Genetica inversa alla portata di tutti. Genome-wide functional screenings. Terapia genetica antitumorale. Rivoluzione nella comprensione dei meccanismi di regolazione dellespressione genica.


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