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Felix qui potuit rerum cognoscere causas Lucrezio (De rerum natura)

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Presentazione sul tema: "Felix qui potuit rerum cognoscere causas Lucrezio (De rerum natura)"— Transcript della presentazione:

1 Felix qui potuit rerum cognoscere causas Lucrezio (De rerum natura)

2 Come si ottiene un aumento di flusso? * In lievito nello switch tra fermentazione a respirazione (DeRisi, 1997) * Nel seme durante la mobilizzazione delle riserve lipidiche (Rylott, 2001) * Sintesi dei lipidi durante lembriogenesi di Arabidopsis (OHara, 2002) * Altri esempi (vedi Fell) Esaminiamo alcuni esempi di aumenti di flusso in vivo Aumentando S Sottraendo P Aumentando enzima Aumentando attività Causano aumenti locali che faticano a propagarsi lungo la via (dampening)

3 Diauxic shift in yeast Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale (DeRisi et al., 1997) Quali sono i geni che vengono attivati e quali vengono disattivati nella transizione da fermentazione a respirazione? Microarray con tutti i geni di lievito ibridato con mRNA a vari tempi di crescita Rosso = Aumento Verde = Diminuzione

4 Seguiamo i trascritti nel tempo

5 Passando da fermentazione a respirazione cosa cambia nel metabolismo? PYK1 4.9 Variazione Gene interessato Rosso = Aumento Verde = Diminuzione

6 Molti geni sono regolati in modo simile

7 Variazione coordinata di molti geni E possibile classificare i geni in base alla regolazione: 6 classi

8 Lipid mobilization in Arabidopsis germinating seeds Schematic representation of the pathways involved in storage lipid mobilization in oilseeds: 1, ACX; 2, multifuctional protein; 3, thiolase; 4, MS; 5, ICL; 6, PEPck.

9 Northern analysis (A) Stages of seedling development (B) Northern blot analysis of gene expression from 0 to 8 days after imbibition Rylott EL, Hooks MA, Graham IA.Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.

10 Enzimi coinvolti ACC Malonyl-CoA transacilasi KAS III, II & I FAS - Acido grasso sintasi

11 Lipid synthesis during embryogenesis FAS Components Exhibit Constant mRNA Ratios 3-oxoacyl-ACP reductase (KR) biotin carboxylase (BC) acyl-ACP thioesterase (TE) enoyl-ACP reductase (ENR) acyl-carrier protein (ACP) O'Hara, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:

12 Abbondanza relativa dei trascritti It was demonstrated recently that mRNAs encoding the four subunits of heteromeric (ACCase) acetyl- CoA carboxylase accumulate at a constant molar ratio throughout silique development in Arabidopsis. The ratios were found to be CAC1:CAC2:CAC3:(accD-A & accD-B) = 0.14:1.0:0.17:0.06 (Ke et al., 2000)

13 Via del triptofano in lievito Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔE i (ΔJ C J x ΔE i )

14 Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G. (2008) Combinatorial pathway analysis for improved L-tyrosine production in Escherichia coli: identification of enzymatic bottlenecks by systematic gene overexpression. Metab Eng. 10:69-77.

15 Come fa la natura? Strategia multisito! Molti altri esempi: Lipogenesi nei tessuti animali Fotosintesi Ciclo dellurea Gluconeogenesi Sintesi degli steroidi Operoni batterici, enzimi di fusione… ……u.s.w.

16 Il metodo universale N S P B J 1 = J 2 + J 3 J1J1 J2J2 J3J3 Per aumentare J 3 di 5 volte, dovremo amplificare tutti gli enzimi che da S portano a P di 5 volte. Questo comporta un consumo di addizionale di S. Se vogliamo mantenere intatta [S], occorre aumentare J 1 fino al valore di (J 2 +5J 3 ) J 1 '= (J 2 + J 3 ') = (J 2 + 5J 3 ) Se J 2 >> J 3 allora si può trascurare di aumentare J 1. In caso contrario si rischia di danneggiare J 2

17 J 1 = J 2 + J 3 + J 4 + J 5 J 1 = (J 2 + J 3 + J 4 + 5J 5 ) Il metabolismo è chiaramente più complesso, con tanti flussi diversi, presenza di cicli con cofattori (major obstacle) Si può risalire da P verso N lungo le vie metaboliche fino a dove laumento di flusso può essere trascurato. N P S1S1 B1B1 S3S3 S2S2 B2B2 B3B3 J1J1 J2J2 J5J5 J3J3 J4J4

18 Se il metodo universale viene implementato in vivo, ci aspettiamo che: Quando la quantità degli enzimi cambia in risposta a stimoli fisiologici o ambientali, la proporzione relativa rimane costante. Il fattore di aumento dellattività enzimatica corrisponda al fattore di aumento del flusso. Il livello di cambiamento sia maggiore nel ramo metabolico interessato mentre i tratti a monte della ramificazione vadano incontro a cambiamenti di entità minore. Oltre allinduzione degli enzimi interessati (maggior quantità) altri meccanismi di controllo possono essere adoperati in diversi siti. Phenotype is flux! Ma qualche volta phenotype is concentration

19 Evidenze sperimentali Reguloni! La concentrazione dei metaboliti varia molto meno del flusso * Rate limiting step concept: more misguided than even MCA initially suggested * Agire su un solo punto è poco efficace e potrebbe essere deleterio Il metodo universale mantiene costanti le concentrazioni dei metaboliti [S i ] evita effetti negativi dovuti allaumento o alla riduzione di [S i ]

20 Referenze Referenze ai lavori sugli aumenti naturali in vivo Vedi anche Fell ultimo cap * DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278:680-6.DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. * O'Hara P, Slabas AR, Fawcett T. (2002) Fatty acid and lipid biosynthetic genes are expressed at constant molar ratios but different absolute levels during embryogenesis. Plant Physiol. 129:310-20O'Hara P, Slabas AR, Fawcett T. * Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. * Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287: * Zhao J, Last RL.(1996) Coordinate regulation of the tryptophan biosynthetic pathway and indolic phytoalexin accumulation in Arabidopsis. Plant Cell. 8: * Eastmond PJ, Rawsthorne S. (2000) Ccoordinate changes in carbon partitioning and plastidial metabolism during the development of oilseed rape embryos. Plant Physiol. 122: * Universal method: Kacser and Acerenza (1993) A universal method for achieving increases in metabolite production Eur J. of Biochemistry 216:


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