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Le Cicline UNIVERSITA DEGLI STUDI DI TORINO SCUOLA UNIVERSITARIA INTERFACOLTA PER LE BIOTECNOLOGIE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI.

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1 Le Cicline UNIVERSITA DEGLI STUDI DI TORINO SCUOLA UNIVERSITARIA INTERFACOLTA PER LE BIOTECNOLOGIE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI Corso di biochimica prof. Tiziana Crepaldi Luca Orlando

2 Le Cicline Cicline Mitotiche (M) B1/B2 Cdk1 D1/D2/D3 Cdk4/6 D1/D2/D3 Cdk4/6 E1/E2Cdk2 Altre cicline Cicline G1 A1/A2 A1/A2 Cdk2/1 F, G, H BDEA Cicline G1/S Cicline S

3 Cicline Mitotiche Mitosi scatenata da complesso B-Cdk1 attivato dopo Mitosi scatenata da complesso B-Cdk1 attivato dopo completamento della fase S Lattivazione B-Cdk comincia con laccumulo della Lattivazione B-Cdk comincia con laccumulo della ciclina mitotica durante fase G2 Alberts, 4th edition

4 Il complesso B-Cdk1 attivato media tutti gli eventi Il complesso B-Cdk1 attivato media tutti gli eventi cellulari necessari per la mitosi (condensamento cromosomi, assemblamento fuso mitotico,riarrangiamento citoscheletro di actina/microtubuli, dissassemblamento della lamina nucleare…) Uno dei ruoli più importanti è mediare lattivazione di Uno dei ruoli più importanti è mediare lattivazione di APC (anafase promoting complex)La sua attività proteolitica permette lo svolgimento dellanafase e la proteolisi della ciclina B, terminando la mitosi. Alberts, 4th edition

5 Negli embrioni precoci linattivazione di B-CdK1 è data Negli embrioni precoci linattivazione di B-CdK1 è data interamente dallazione di Cdc20-APC Cellule però con fase G1 hanno bisogno di meccanismo Cellule però con fase G1 hanno bisogno di meccanismo protettivo da riattivazione di CdK protettivo da riattivazione di CdK Interviene molecola simile a cdc20 attivante APC: Htc1 Interviene molecola simile a cdc20 attivante APC: Htc1 Alberts, 4th edition

6 Quindi lattività di Htc1-APC inizia quando cdc20-APC comincia la distruzione della ciclina B Cdc20-APC attivato da B-Cdk1 Htc1-APC inibito da B-Cdk1 (fosforilazione diretta di Hct1) Alberts, 4th edition

7 ko delle cicline B ko delle cicline B cicline B1 e B2 sono entrambe coespresse nella maggior cicline B1 e B2 sono entrambe coespresse nella maggior parte delle cellule dividenti B1 citoplasmatica, associata a microtubuli B2 associata alla membrana interna Hanno inoltre diverso pattern di espressione durante spermatogenesi murina ruoli specializzati diversi diversa localizzazione subcellulare diversa localizzazione subcellulare

8 vengono generati ceppi omozigoti per il gene ciclina B vengono generati ceppi omozigoti per il gene ciclina B deleto della Ciclin Box, sito di contatto con Cdk1 Brandeis et al., 1998 B2 -/- Vitali, leggermente più piccoli, fertili, nessun tessuto anormale. B1 -/- Letalità embrionale. B1 gene fondamentale B1 probabilmente riesce a sopperire alla mancanza di B2 B1 probabilmente riesce a sopperire alla mancanza di B2 portando Cdk1 sui substrati di B2. B2 essendo associato alla membrana non riuscirebbe B2 essendo associato alla membrana non riuscirebbe a sopperire alla mancanza di B1

9 Cicline G1 Cicline D (1/2/3) agiscono precocemente complessando Cicline D (1/2/3) agiscono precocemente complessando con Cdk4/6 sotto stimolo di mitogeni Persiste o viene risintetizzata in base al tipo cellulare Persiste o viene risintetizzata in base al tipo cellulare La sua azione opera su gli inibitori Rb e p27 La sua azione opera su gli inibitori Rb e p27 Sherr., 2004

10 Cicline G1 Attivazione E-Cdk2 amplifica effetto su Rb e p27 Attivazione E-Cdk2 amplifica effetto su Rb e p27 ma in modo diverso: passaggio a indipendenza da mitogeni (Sherr., 2004) I substrati sono coinvolti direttamente nel ciclo cellulare I substrati sono coinvolti direttamente nel ciclo cellulare (istoni, centrosomi, origine di replicazione...) La ciclina E viene poi degradata per P diretta da Cdk2 La ciclina E viene poi degradata per P diretta da Cdk2 GSK-3B. Cdk2 lega poi con ciclina A estendendo ruolo sino a fase G2

11 ko delle cicline D ko delle cicline D D1 -/- : Vitale, più piccolo, anomalie alla retina/mammella D2 -/- : Vitale, femmine non fertili, difetti celebrali e in LB D3 -/- : Vitale. no maturazione LT nel Timo tessuto colpito specifico per quella ciclina: Ridondanza Doppio Ko: combinazione dei Ko singoli Doppio Ko: combinazione dei Ko singoli Es:D2/3 -/- (solo D1): Morte prenatale per anemia megaloblastica (no linfociti maturi) megaloblastica (no linfociti maturi) Cè però sviluppo e organogenesi Basta una sola ciclina? Proliferazione indipendente da ciclina D?

12 Triplo KO: morte intrauterina ma dopo organogenesi Triplo KO: morte intrauterina ma dopo organogenesi (Kozar et al., 2004) Proliferazione indipendente da D Proliferazione indipendente da D Livello di E, A Cdk2 non Livello di E, A Cdk2 non modificato (compensazione Cdk2 /altri meccanismi) MEFs incapaci di uscire da Go MEFs incapaci di uscire da Go D fondamentale per sviluppo SC KO Cdk4/6 Singolo: Vitale Singolo: Vitale Doppio: Simile effetto KO cicline D Doppio: Simile effetto KO cicline D Cdk2 capace di legare D in vitro: complementazione? Cdk2 capace di legare D in vitro: complementazione?

13 KO Cdk2 Vitali (fino a 2 anni!), sterili. Vitali (fino a 2 anni!), sterili. MEFs proliferano bene dificoltà passaggio G0/ G1 MEFs proliferano bene dificoltà passaggio G0/ G1 KO Cicline E Singolo E1/E2: Vitale. Singolo E1/E2: Vitale. Doppio: Aborto per malformazione trofoblasti Doppio: Aborto per malformazione trofoblasti Embrioni tetraploidi: morte prenatale per Embrioni tetraploidi: morte prenatale per anomalie cardiache anomalie cardiache MEFs incapaci di uscire da G0 MEFs incapaci di uscire da G0 Gene essenziale:Fenotipo più grave che mancanza Gene essenziale:Fenotipo più grave che mancanza di Cdk2: ciclina E indipendente da Cdk2 o altro partner sconosciuto.

14 CONCLUSIONI Negli eucarioti la presenza di Cdk molteplici permette Negli eucarioti la presenza di Cdk molteplici permette aumento di combinazioni (più specificità) ma anche possibilità di interscambio La perdita di complessi G1- Cdk è complementato da La perdita di complessi G1- Cdk è complementato da isoforme o da altre cicline conosciute/sconosciute IL fatto che vengano attivati effettori a valle anche con IL fatto che vengano attivati effettori a valle anche con ko indica la presenza di meccanismi alternativi Complesso D-Cdk e Cdk2 non sono essenziali per il Complesso D-Cdk e Cdk2 non sono essenziali per il ciclo cellulare cellule somatiche. Sono però fondamentali assieme ad E per luscita dalla quiescenza (G0)

15 IMPLICAZIONI NEL CANCRO Cicline D/E fondamentali per uscita quiescenza di SC Cicline D/E fondamentali per uscita quiescenza di SC Importanza in Cancer Stem Cells? MEFs mancanti di cicline G1 o relative Cdk resistenti MEFs mancanti di cicline G1 o relative Cdk resistenti allazione di oncogeni come Ras, Myc p53DN IN VIVO: Cdk4 -/- : refrattari a tumori alla pelle mediato IN VIVO: Cdk4 -/- : refrattari a tumori alla pelle mediato da Ras, mentre i cheratinociti proliferano da Ras, mentre i cheratinociti proliferano normalmente normalmente D1 -/- : protezione da tumore alla mammella e D1 -/- : protezione da tumore alla mammella e intestinale intestinale (Kozar et al., 2004)

16 Cicline G1 possibile target antitumorale? PRO Mancanza di G1- Cdk attivato non sembra coinvolgere la funzionalità e proliferzione coinvolgere la funzionalità e proliferzione delle cellule somatiche delle cellule somatiche Un solo target conferisce resistenza Un solo target conferisce resistenza CONTRO Implicazione delle cicline non ancora chiarita Effetto solo con alcuni oncogeni (es Ras) Effetto solo con alcuni oncogeni (es Ras) G1- Cdk fondamentale per differenziazione G1- Cdk fondamentale per differenziazione stem cells. stem cells.

17 BIBLIOGRAFIA Development of mice expressing a single D-type cyclin Maria A. Ciemerych, Anna M. Kenney, Ewa Sicinska, Ilona Kalaszczynska, Roderick T. Bronson, David H. Rowitch, Humphrey Gardner, and Piotr icinski1 GENES& DEVELOPMENT 16:3277–3289 Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint control Geoffrey I. Shapiro and J. Wade Harper Cyclin B2-null mice develop normally and are fertile whereascyclin B1-null mice die in utero MICHAEL BRANDEIS, IAN ROSEWELL, MARK CARRINGTON, TESSA CROMPTON, MARY ANN JACOBS, JANE KIRK,JULIAN GANNO, AND TIM HUNT Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 4344–4349, April 1998 Journal of Clinical Investigation December 1999 | Volume 104 | Number Mouse Development and Cell Proliferation in the Absence of D-Cyclins Katarzyna Kozar Maria A. Ciemerych,Vivienne I. Rebel Hirokazu Shigematsu, Agnieszka Zagozdzon, Ewa Sicinska,Yan Geng, Qunyan Yu, Shoumo Bhattacharya, Roderick T. Bronson, Koichi Akashi, Cell, Vol. 118, 477–491, August 20, 2004, Living with or without cyclinsand cyclin-dependent kinases Charles J. Sherr1, and James M. Roberts GENES & DEVELOPMENT 18:2699–2711


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