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06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it1 LANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia AO Ospedali Riuniti di Bergamo.

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1 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it1 LANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia AO Ospedali Riuniti di Bergamo

2 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it2 Diagnosi microbiologica îIl ruolo dei laboratori di microbiologia clinica consiste essenzialmente nell'effettuare una diagnosi presuntiva îTutti i laboratori debbono essere in grado di sospettare la presenza di B. anthracis îNel sospetto il campione e/o le colture devono essere inviate ad un laboratorio, che possegga aree di lavoro corrispondenti al terzo livello di contenimento (P3), per la diagnosi definitiva.

3 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it3 B.anthracis îè aerobio e anaerobio facoltativo îimmobile, sporigeno e, se ceppo virulento, capsulato înon-emolitico su agar sangue di montone îsensibile alla penicillina (salvo rarissimi ceppi, più spesso modificati) îpuò presentarsi in due diverse forme: –in forma vegetativa (1-1,5 x 3-8 m) –in forma di spora (1 m).

4 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it4 B.anthracis: forma vegetativa îla forma vegetativa (fase di attiva moltiplicazione) è quella che si riscontra nelle lesioni cliniche, nei relativi campioni biologici e di conseguenza nelle colture microbiologiche îsolo la forma vegetativa è in grado di produrre le tossine (antigene protettivo, fattore letale, fattore edemigeno) e la capsula, due dei fattori di virulenza îtale forma vegetativa è facilmente distrutta dai disinfettanti comunemente utilizzati in ospedale, in particolare da quelli a base di cloro

5 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it5 B.anthracis: spore îla forma di spora (fase di quiescenza) è quella che il microorganismo acquista in situazione di svantaggio e gli consente la sopravvivenza (in presenza di ossigeno atmosferico, nella terra e nel suolo, in acqua, polveri, pellami, ….) îsolo nel momento in cui si ritrova in un ambiente favorevole (inoculazione di spore attraverso lesioni cutanee, ingestione con acqua o alimenti, inalazione di unelevata quantità di spore) riprende la capacità di moltiplicarsi e di dare danno île spore sono particolarmente resistenti nellambiente (sopravvivono anni) e non sono distrutte dai comuni disinfettanti

6 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it6 Biosicurezza (1) îB. anthracis non è contagioso da persona a persona îL'infezione cutanea avviene solo attraverso soluzioni di continuo della cute e la forma da inalazione necessita di una elevata carica di spore, per cui il rischio di trasmissione in laboratorio è praticamente nullo îPer i campioni potenzialmente infetti, adottare misure almeno del 2° livello di contenimento (cappa a flusso di classe 2 con filtri HEPA, indumenti di protezioni personale -camici monouso, guanti di lattice, mascherine, occhiali o schermi di protezione-)

7 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it7 Biosicurezza (2) îLe procedure devono essere eseguite da microbiologi o tecnici di microbiologia esperti îNel caso si giunga ad una identificazione presuntiva della presenza di B.anthracis, è sconsigliato allestire ulteriori procedure identificative. Il campione e/o la coltura devono essere inviati ad un laboratorio di riferimento per la diagnosi definitiva.

8 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it8 Decontaminazione îLe superfici che possono essere state a contatto con materiali infetti devono essere decontaminate con prodotti a base di cloro in concentrazione di: –5.000 ppm (es. ipoclorito di sodio 5,25% -la comune candeggina- diluito 1:10) * –10.000 ppm (come sopra, diluendo 1:5) ** îGli altri materiali devono essere autoclavati seguendo le procedure in vigore nel laboratorio per i materiali infetti il CDC consiglia luso di diossido di cloro (gas) per il trattamento di ambienti contaminati da spore îCDC, Guidelines for State Health Dpt (14.10.01) îPHLS Provisional guidelines for action in the event of a deliberate release (11.10.01)

9 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it9 Esame diretto dei campioni clinici îAllestire due vetrini con uno striscio del materiale in esame: fissarli per 1 minuto con etanolo assoluto oppure 10 min con metanolo îColorare un vetrino con il Gram e uno con il Giemsa e osservarli al microsopio in immersione îLa presenza al Gram di grossi bacilli Gram-positivi (1- 1.5 X 2-8 mm), con estremità squadrate e in corte catene di 2-4 cellule suggerisce la presenza di B. anthracis îLa colorazione di Giemsa può mettere in evidenza la presenza di capsula

10 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it10 Gram di B. anthracis da sangue di scimmia (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

11 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it11 Gram di B. anthracis da agar sangue (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

12 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it12 Gram di B. anthracis con spore (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

13 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it13 Esame colturale (1) Tampone nasale îsemina diretta su piastre di AS îutile anche semina dopo trattamento termico o con alcool per eliminare la flora commensale –stemperare il tampone in 1 ml circa di diluente (soluzione fisiologica o brodo) e sottoporre la sospensione a shock termico (bagnomaria a 65°C per 10 min.), oppure a shock etanolico (aggiungere pari volume di alcool etilico assoluto per 30 min.) –dopo trattamento possono essere seminate, per inondazione, una o più piastre di AS con 0,1 ml della sospensione.

14 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it14 Esame colturale (2) Altri campioni îB.anthracis cresce rapidamente sui comuni terreni colturali, ma non su MacConkey îallestire una coltura su Agar Sangue di montone (AS): su questo terreno è possibile evidenziare alcune caratteristiche distintive di B.anthracis îallestire in contemporanea colture su altri tipi di terreni, secondo le procedure in uso nel laboratorio per i diversi tipi di campioni clinici îincubare a 35°-37° C in un termostato ad aria per 18- 24 ore

15 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it15 Caratteristiche colturali (1) Aspetto delle colonie (su AS dopo 15-24 ore a 35-37°C) îcolonie di 2-5 mm, biancastre, a vetro smerigliato, rotonde o irregolari, piane o leggermente convesse, con margini frastagliati e proiezioni a forma di virgola che protrudono dal bordo della colonia (aspetto a caput Medusae) înon emolitiche, a differenza di quelle di altre specie, quali B. cereus e B. thuringiensis, che producono su AS beta emolisi (emolisi completa) îcon consistenza notevole, appiccicose e filanti, quando raccolte con un'ansa

16 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it16 Caratteristiche colturali (2) Aspetto delle colonie (su Agar cioccolato dopo 15-24 ore a 35-37°C) îmucose, se il ceppo è capsulato îla capsula si forma in presenza di CO 2, o in terreni contenenti bicarbonato di sodio 0,7%

17 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it17 Caratteristiche colturali (3) îLa rapidità di crescita (12-15 ore ) di B. anthracis può essere sfruttata per isolare il microrganismo da una coltura mista îAl Gram i batteri cresciuti su AS in aria: –non presentano capsula –appaiono come lunghe catene di bacilli Gram- positivi –contengono spore, più o meno numerose, centrali o subterminali, ovali, che non dilatano il corpo batterico.

18 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it18 Morfologia delle colonie di B. anthracis (da agar sangue, dopo 18-24 ore) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

19 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it19 Colonie appiccicose di B. anthracis, da agar sangue www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

20 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it20 Test addizionali

21 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it21 B. cereus (destra) e B. anthracis (snistra), su agar sangue, dopo 24 ore www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

22 06.11.01Antrace 4 - www.apsi.it22 Fonti bibliografiche îISS (www.iss.it) îJAMA, 1999, Consensus statement îN Engl J Med, 1999, Dixon e al. îCDC (www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf) îPHLS (www.phls.co.uk/advice/anthrax_guidelines.pdf) îlinks: www.apsi.it


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