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Leffetto ossigeno in radiobiologia Università Cattolica del Sacro Cuore Scuola di specializzazione in Fisica Sanitaria 2003-2004 Claudia DellOmo.

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1 Leffetto ossigeno in radiobiologia Università Cattolica del Sacro Cuore Scuola di specializzazione in Fisica Sanitaria Claudia DellOmo

2 Fattori fisici Fattori biologici Fattori chimici FATTORI CHE INFLUENZANO LEFFETTO DELLE RADIAZIONI

3 alta o bassa intensità la dose può essere somministrata come dose singola o frazionata alto o basso trasferimento lineare di energia (LET) Fattori fisici: Curve di sopravvivenza di cellule dopo irradiazioni con dose di raggi x e neutroni. basso LET alto LET

4 fasi del ciclo cellulare in rapporto allefficacia delle radiazioni nel provocare la morte cellulare recupero del danno radiosensibilità e radioresistenza dei tessuti in riferimento alla loro attività proliferativa e al grado di differenziazione Fattori biologici: Sopravvivenza della capacità riproduttiva di cellule HeLa irradiate con raggi x in quattro differenti momenti del ciclo cellulare: M, G 1, G 2 e fase S del DNA. Esistono differenze di un fattore o due nella dose richiesta per un determinato livello di morte cellulare tra le diverse fasi del ciclo.

5 protettori: agenti che riducono leffetto di una determinata dose di radiazione sensibilizzanti: agenti che aumentano lefficacia di una determinata dose di radiazione, lossigeno è un potente sensibilizzante. Fattori chimici: In presenza di O 2 tutti i sistemi biologici sono molto più sensibili alla radiazione Il grado di sensibilizzazione è espresso in termini di Oxygen Enhancement Ratio: per produrre lo stesso effetto biologico.

6 Oxygen Enhancement Ratio – x rays OER ha valori tipici di 2,5 – 3 per raggi x e curva A: cellule ben ossigenate curva B: cellule poco ossigenate Per un livello di effetto E, la dose in condizioni di ossigenazione (4 Gy) è 2,5 volte inferiore alla dose richiesta in condizioni di ipossia (10 Gy). O 2 è perciò un agente dose-modifying per radiazioni a basso LET. Curve di sopravvivenza per cellule esposte a raggi x in condizioni ipossiche e non.

7 Oxygen Enhancement Ratio –altre radiationi OER ha valori tipici < 2 per radiazioni densamente ionizzanti Curve di sopravvivenza per cellule esposte a radiazioni adroniche in condizioni ipossiche e non. Per radiazioni ad alto LET, si nota una diminuzione dellOER al crescere del LET. Ad esempio, per particelle (la curva di sopravvivenza non ha la spalla cioè è una funzione esponenziale della dose), le cellule ipossiche ed ossigenate vengono uccise con uguale facilità, ciò vuol dire OER = 1.

8 Efficacia dellO 2 come agente modificante per le radiazioni ad elevato e basso LET Coppie di curve di sopravvivanza per cellule sottoposte ad irradiazione a LET elevato e basso in condizioni di ossigenazione e di ipossia. Nel primo caso lOER 1 lO 2 non modifica leffetto della radiazione ad alto LET.

9 Perché cè riduzione delleffetto O 2 allaumentare del LET? Spiegazione più probabile: nei densi percorsi di ionizzazione delle radiazioni ad elevato LET cè produzione di O 2, questo ossigena e così sensibilizza le cellule al momento dellirradiazione. Relazione tra LET, EBR ed OER

10 Tempi di azione Affinchè si osservi leffetto ossigeno, è necessario che lossigeno sia presente: - durante lesposizione alla radiazione Wright, Howard-Flanders, Acta Radiol 48, 1957 Howard-Flanders P., Moore D., Radiat Res 9, entro pochi millisecondi dopo lirradiazione Michael BD et al., Radiat Res 54, 1973 Lidea di questo ultimo esperimento è che lossigeno, contenuto in una camera ad alta pressione, venga fatto esplodere su uno strato singolo di batteri in vari tempi: prima, durante e dopo lirradiazione con un impulso di elettroni di 2 sec dato da un acceleratore lineare. Il risultato è che lossigeno agisce come sensibilizzante se esso viene aggiunto non più tardi di 5 msec dopo lirradiazione.

11 Concentrazione richiesta di ossigeno Dipendenza della radiosensibilità dalla concentrazione di ossigeno. Assegnando 1 alla radiosensibilità in condizioni anossiche, si trova sperimentalmente che essa diventa 3 in condizioni di ossigenazione. La variazione di sensibilità si realizza soprattutto quando la concentrazione di ossigeno passa da 0 a 30 mm Hg. Dopo, si realizza un plateau.

12 Il meccanismo delleffetto ossigeno (1) Catena di eventi Interazioni iniziali Radiazioni indirettamente ionizzanti (X,, n) – s Radiazioni direttamente ionizzanti (e -, p) – s Stadio fisico-chimico Deposito di energia come ionizzazioni delle strutture molecolari lungo il percorso – s Danno chimico Radicali liberi10 -7 s - ore Danno biomolecolare Proteine, acidi nucleicims - ore Effetti biologici precoci Morte cellulare, morte animaleore - settimane Effetti biologici tardivi Induzione di neoplasie, effetti geneticianni - secoli Limiti di tempo

13 Radiochimica dellacqua; ipotesi della fissazione del danno H 2 O H 2 O + + e - e - + H 2 O H 2 O - H 2 O +, H 2 O - sono instabili: H 2 O + H + + OH° H 2 O - H ° + OH - radiation RH + OH° R° + H 2 O RH + H° R° + H 2 H°, OH° sono radicali liberi, cioè atomi o molecole elettricamente neutri aventi un elettrone spaiato rispetto allo spin nellorbita esterna. Sono molto reattivi, con una grande tendenza ad accoppiare lelettrone spaiato (ossidante) oppure a eliminare lelettrone spaiato (riducente). Ad es., possono estrarre idrogeno da molecole organiche RH: R° sono radicali liberi secondari che possono interagire con molecole biologicamente importanti e provocare danni azione indiretta delle radiazioni ionizzanti In presenza di O 2 : R° + O 2 RO 2 ° Formazione del radicale organico perossido, che può attivare una reazione a catena che coinvolge più RH RO 2 ° + RH RO 2 H + R° Fissazione del danno biologico, cioè cambiamento stabile della composizione chimica del target potenziamento dellefficacia delle radiazioni

14 Il meccanismo delleffetto ossigeno (2)

15 Effetto ossigeno e radioterapia Thomlinson & Gray (1955) key paper Conclusioni ottenute da Thomlinson e Gray dallo studio di sezioni istologiche di carcinoma bronchiale umano. Conclusioni schematizzate del lavoro di Thomlinson e Gray: -ogni centro tumorale con raggio maggiore di 200 m presenta un centro necrotico -nessuna necrosi è presente in tumori con raggio minore di 160 m -Comunque grande sia il raggio del centro necrotico, lo spessore esterno composto di cellule tumorali attive non è mai maggiore di 180 m ed è sempre compreso tra 100 m e 180 m. Larea delle cellule tumorali attive appare, in sezione, come un anello

16 Effetto ossigeno e radioterapia Conclusioni del lavoro di Thomlinson e Gray: Le cellule tumorali proliferano e crescono attivamente soltanto se sono in prossimità di una sorgente di ossigeno o nutrienti (stroma). Fino a 150 m dal capillare le cellule sono ossigenate; a distanze maggiori lossigeno è consumato e le cellule diventano necrotiche. Le cellule ipossiche formano uno strato (di una o due cellule) nel quale la concentrazione di ossigeno è alta abbastanza da permettere la loro attività e bassa abbastanza da renderle relativamente protette dagli effetti dei raggi x. Diffusione dellO 2 da un capillare 150 m Conclusioni ottenute da Thomlinson e Gray dallo studio di sezioni istologiche di carcinoma bronchiale umano.

17 Effetto ossigeno e radioterapia Powers & Tolmach, 1973 Prima evidenza di cellule ipossiche in tumore - La curva ha due distinte componenti, di due diverse pendenze (bifasica). Ciò suggerisce che il tumore consiste di due gruppi separati di cellule, uno ossigenato e laltro ipossico. -Estrapolando dalla regione di alte dosi allasse di sopravvivenza si ottiene la frazione di cellule ipossiche al tempo di irradiazione: livello di sopravivvenza = 1 % Circa 1 % delle cellule clonogeniche nel tumore hanno una curva di sopravivvenza tipica di cellule ipossiche. Risposta alla radiazione di un linfosarcoma subcutaneo solido nel topo A basse dosi (< 900 rad) la risposta è dominata dal killing delle cellule ossigenate. Ad alte dosi (> 900 rad) la risposta è dominata dal killing delle cellule ipossiche. Prima evidenza inequivocabile che un tumore solido contiene una percentuale di cellule clonogeniche sufficientemente ipossiche da essere radioresisrtenti

18 Effetto ossigeno e radioterapia Determinazione pratica della frazione di cellule ipossiche Mouse tumour curva aerobica – Animale respira aria – Mistura di cellule ipossiche e aerate curva ipossica – Animale asfissiato mediante respirazione di N 2 curva ossica – Cellule in vitro in O 2 La frazione ipossica è 20 %: (la distanza verticale tra la curva ipossica e quella in aria sullasse della frazione di sopravvivenza va da 1.0 a 0,2)

19 Effetto ossigeno e radioterapia Introduzione alla reossigenazione Sperimentalmente è stato dimostrato che la proporzione di cellule ipossiche nel tumore è circa costante, cioè la stessa sia nel tumore non trattato che dopo il trattamento frazionato. Spiegazione: durante il trattamento, le cellule si muovono dal compartimento ipossico a quello ossigenato. Se così non fosse la proporzione di cellule ipossiche dovrebbe aumentare durante il trattamento perché la radiazione dovrebbe spopolare più il compartimento delle cellule aerate che quello delle cellule ipossiche REOSSIGENAZIONE

20 Effetto ossigeno e radioterapia Il meccanismo della reossigenazione I tumori umani si reossigenano rapidamente ed efficientemente, come la maggior parte di quelli animali, tra due frazioni di dose. Ogni frazione di dose uccide una proporzione molto più grande di cellule ossigenate che di cellule ipossiche. Il processo di riossigenazione ristabilisce la proporzione di cellule ipossiche (ad es. all 1 %) prima che venga irradiata la prossima frazione di dose, quindi il compartimento di cellule ipossiche non diventa mai dominante. Mentre il numero di cellule ossigenate diventa sempre più piccolo, sempre più cellule ipossiche si muovono nel compartimento ossigenato per mantenere la proporzione di cellule ipossiche all 1 %. La morte delle cellule che erano ipossiche allinizio del trattamento è perciò un risultato della loro irradiazione quando sono diventate ossigenate.

21 La presenza di un piccolo numero di cellule ipossiche (radioresistenti) può spiegare la differenza tra il successo e linsuccesso nella terapia di un tumore. Esse rappresentano un focus per la ricrescita del tumore. Effetto ossigeno e radioterapia Dose di radiazioni necessaria per uccidere tutte le cellule nei volumi indicati. Si ipotizza che i tumori che non rispondono bene alla radioterapia sono quelli che non si reossigenano velocemente ed efficientemente. conclusione

22

23 Effetto ossigeno e radioterapia Tumori (animali) includono Cellule aerate Cellule ipossiche Lipossia conferisce protezione da Raggi x Agenti Chemioterapici La presenza of O 2 aumenta il cell killing La reossigenazione delle cellule ipossiche può migliorare il trattamento contro il tumore mediante radiation therapy. conclusioni E una ipotesi plausibile che i tumori che non rispondono bene alla radioterapia sono quelli che non si reossigenano velocemente ed efficientemente.


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