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Physiological apoptosisautophagicother Cell death Necrotic Caspase-dependentCaspase-independent receptor-caspase 8 mitochondria-caspase 9 Classification.

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1 Physiological apoptosisautophagicother Cell death Necrotic Caspase-dependentCaspase-independent receptor-caspase 8 mitochondria-caspase 9 Classification of cell death

2 Il segnalamento apoptotico

3 Weinberg Fig 9.18 Different parts of the apoptotic programme. Markers for the process. Two lymphocytes Healthy Apoptoti c Fragmentation of Golgi bodiesPhosphorylation of Histone 2B Phagocytosis of apoptotic bodies Fragmentation of DNA Staurosporin-treated HeLa cells Apoptotic cell Apoptosi s Pyknotic nuclear fragments

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5 Caratteristiche morfologiche associate a morte cellulare che portano alla dissoluzione della cellula e alla fagocitosi. Caratteristiche biochimiche associate a morte cellulare –Frammentazione del DNA a livello internucleosomale con formazione di frammenti di 200bp e multipli –Alterazione della compartimentalizzazione di lipidi di membrana con esposizione della fosfatidilserina e altre proteine riconosciute dai fagociti Apoptosi Apoptosi: frammentazione del DNA

6 APOPTOSI Proteolisi di molecole regolatorie e strutturali Via intrinseca o mitocondriale rilascio di citocromo C Famiglia Bcl-2 Via finale comune: Attivazione di una cascata di proteasi (CASPASI) bid Via estrinseca o citoplasmatica recettori della morte Fas:fasL

7 L’apoptosi può cominciare a seguito di diversi stimoli quali: 1. Deprivazione di fattori di crescita 2. Radiazioni UV e  3. Chemioterapici 4. Recettori della morte (famiglia TNFR) I RECETTORI DELLA MORTE TNF-R1 (CD120a) CD95 (APO-1:Fas) DR3 (APO-3, LARD, TRAMP, WSL1) TRAIL-R1 (APO-2, DR4) TRAIL-R2 (DR5, KILLER, TRICK2) DR6 possiedono un dominio intracellulare definito “death domain” (DD), essenziale per la trasduzione del segnale apoptoticoDDDD MEMBRANA CELLULARE

8 TNF  TNFR MMP I ligandi dei recettori della morte sono trimeri di membrana che vengono rilasciati da metalloproteinasi di matrice (MMPs) Segnalamento apoptotico-Ruolo della Matrice Extracellulare LIGANDI:TNF  prodotto da monociti/macrofagi TWEAK (APO-3L) FasLFasL-Fas system = linfociti T citotossici Linfotossina (LT , LT  prodotti da linfociti attivati LIGHT TRAIL (APO-2L)

9 A seguito della trimerizzazione i recettori della morte legano tramite i domini DD delle “molecole adattatrici”: FADD/Mort1 Fas-Associated-Death-Domain protein RIP Receptor-Interacting-Protein TRADD TNF-Associated-Death-Domain protein

10 FADD RIP TRADD

11 Legame di FASL al suo recettore Induzione di trimerizzazione Reclutamento di Fadd e di caspasi 8 (DISC: death-inducing signalling Complex) Attivazione di caspasi 8

12 CARD = Caspase Recruitment Domain Caspasi APAF = Apoptopic Proteases Activating Factors DED = Death Effector Domain Caspasi DEDD TRADD FADD RIP Le caspasi vengono divise in iniziatori e effettori. Le proteine adattatrici legano le caspasi “iniziatrici” connettendo il recettore al “macchinario apoptotico effettore” costituito da una sequenza di caspasi Il segnalamento apoptotico - Gli enzimi “Caspasi” Caspasi Effettori Apoptotici Caspasi Processamento di citochine prima della secrezione

13 Tutte le caspasi sono sintetizzate come zimogeni, e necessitano di essere attivate da taglio proteolitico. L’enzima attivo è un eterotetramero formato da 2 subunità catalitiche di circa 20 kDa e da 2 subunità di circa 10 kDa FADD Attivazione autoproteolitica Attivazione autoproteolitica Pro-Caspasi-8Pro-Caspasi-8 Caspasi 8

14 Le caspasi iniziatrici attivano le esecutrici eventualmente portando la cellula in apoptosi Caspasi-8 Pro-Caspasi3/6/7 Caspasi-3/6/7 Pro-Caspasi-8 FADD TRAF TRADD TNF TNFR APOPTOSI

15 Le IAP (inhibitor of apoptosis) costituiscono una importante classe di regolatori dell’apoptosi cIAP-1 e -2 si legano ai TRAFs (TNF-receptor associated factors) 1 e 2 Survivin é implicata nel controllo del ciclo cellulare XIAP inibisce le caspasi-3, -6 e -7 ML-IAP inibisce le caspasi-3, -7, -9 IAP-1 e IAP-2 XIAP ( X-chromosome-linked inhibitor apoptosis protein ) Survivin ML-IAP Bruce Livin Modulatori delle IAP –Inibitori degli inibitori –Smac/Diablo

16 Inibitori Inibitori di apoptosi: Bcl-2 Bcl-XL Bcl-xs A1 Boo Mcl-1 Promotori Promotori di apoptosi: Bax Bak Bok Bad Bim/Bod Bid Bik/Nbk/Blk Bmk Hrk/DP5 Noxa Puma/Bbc3 La famiglia delle proteine Bcl-2 (B cell lymphoma gene 2) Più di 30 regolatori dell’apoptosi, comprendono INIBITORI e PROMOTORI Si localizzano sulla membrana mitocondriale esterna, del reticolo endoplasmico e del nucleo DIMERI Proteine anti- e pro-apoptopiche formano eterodimeri regolatori. I livelli relativi di queste proteine possono decidere se la cellula muore o sopravvive

17 Il segnalamento apoptotico – La famiglia delle proteine Bcl-2 Pro-Sopravvivenza Famiglia Bcl2 Bcl- X L Bfl-1 Bcl- W Mcl1 (“formatori di canali/pori mitocondriali”) Pro-Apoptosi Famiglia Bax Bak Bok Famiglia BH3-only (“sentinelle dell’apoptosi”) Bid Bad, Bim, Bik, Bmf, Hrk, Noxa, Puma

18 Bad, Bim and Bid sono mantenute inattive in cellula e, se attivate da segnali citotossici, si legano ad altre proteine apoptotiche Transienti di [Ca 2+ ] Taxolo Deprivazione di mitogeni Cellula sana Iniziazione dell’apoptosi Membrana Mitocondriale esterna Deprivazione di Mitogeni

19 Effetti pro-apoptotici del Calcio Chinasi Akt/PKB PKA Bad P SOPRAVVIVENZA Apaf sequestra BAD Bad Bad MORTE Fosfatasi Calcineurina Apaf-1

20 BH3 only Le “BH3-only” nell’attivazione dell’apoptosi Cyto C BH3 only Segnale apoptotico Bid. Bad. Bim. Bik. Bmf. Hrk. Noxa. Puma.

21 Mitocondrio Cyto-C APAF-1 card Bcl-2 Rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrane e rilascio di Apaf-1 (Apoptopic Proteases Activating Factor) che smaschera il dominio CARD di Apaf-1 Cyto-C APAF-1 card Molti stimoli apoptotici sono in grado di avviare l’apoptosi attraverso una via mitocondriale Radiazioni, stress DEX, staurosporina deprivazione mitogeni Ceramide p53 Procaspasi-9 Cyto-C APAF-1card caspasi-9 APOPTOSOMA ATP

22 Pro-Caspasi-8 FADD TRAF TRADD TNF TNFR Il citocromo c è rilasciato anche a seguito di attivazione dei recettori della morte a causa dell’attivazione di Bid da parte di caspasi 8 Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 1 Bcl-2 Bcl-xL Cyt C Bid tBid Bax Bak tBid Bax tBid Bak tBid Bax tBid Bak tBid Bax tBid Cyt C Bcl-2 Bcl-xL Bax tBid Neutralizzazione di Bax o Bak Bak tBid Bax tBid

23 Cyt C Pro-Caspasi-8 FADD TRAF TRADD TNF TNFR Il cit c è rilasciato anche attraverso il PTP. Dal mitocondrio vengono rilasciati anche Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 e AIF Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 2 – il PTP Bcl-2 Bcl-xL AIF Smac/Diablo Omi/HtrA2 AIF AIF = Apoptosis Inducing Factor (attivatore di endonucleasi) Bax Bid tBid Bak tBid Bax tBid Smac/Diablo Smac/DIABLO = second mitochondria- derived activator of caspases/direct IAP- binding protein with low pI Omi/HtrA2 Omi/HtrA2 = serina-proteasi VDAC ANT PTP canale anionico voltaggio-dipendente traslocatore di adenin nucleotide

24 apoptosi sopravvivenza Smac/Diablo Omi/HtrA2 Smac/DIABLO = second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP-binding protein with low pI Omi/HtrA2 = serina-proteasi

25 Mitocondri Circa il 1-5% degli elettroni che “fluiscono” nella catena respiratoria possono essere dirottati a realizzare O2 - a livello del complesso I (NADH/ubiquinone ossidoriduttasi) e complesso III (ubiquinol/citocromo c ossidoriduttasi). O2 - viene poi convertito da SOD mitocondriale in H 2 O 2, che si riversa nel citoplasma. NADPH ossidasi NOX è costitutivamente attivo e produce livelli molto bassi di ROS; in risposta a vari fattori cellulari l’attività di NOX aumenta e aumenta la produzione dei ROS ROS indica i metaboliti parzialmente ridotti dell’O 2. Alcuni di loro tipo O 2 - (anione superossido) e OH - (radicale idrossilico o ossidrile), possono essere definiti come veri radicali liberi. Altri ROS, tipo H 2 O 2, sono più propriamente pro-ossidanti. O2 -, OH - e H 2 O 2 sono i ROS più rilevanti in condizioni fisiologiche e patologiche

26 ROS modulano la funzione di molti enzimi (box) e fattori di trascrizione (ovali) tramite molti segnalamenti intracellulari. Questi segnali cambiano l’espressione genica influenzando la sopravvivenza ela morte HSF1, heat shock transcription factor 1 Lo stress ossidativo attiva numerose e importanti vie di trasduzione dei segnali ROS producono effetti diversi in base alla severità del danno, al tipo di cellula e alla durata dell’esposizione. In genere, basse dosi di ROS, in particolare perossido d’idrogeno, sono mitogenici e promuovono la proliferazione cellulare; dosi intermedie provocano un temporaneo o permanente blocco della crescita

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