CINETICHE ENZIMATICHE

Presentazione sul tema: "CINETICHE ENZIMATICHE"— Transcript della presentazione:

1 CINETICHE ENZIMATICHE
METODI DI MISURA DELLE CINETICHE ENZIMATICHE

2 LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIO
NON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE Allo stato stazionario possiamo solo misurare il flusso in uscita o in entrata, i quali sono uguali tra loro. Possiamo comunque ottenere alcune informazioni sul meccanismo di reazione variando le condizioni sperimentali (dipendenza dal pH)

3 LO STUDIO DELLA CINETICA RAPIDA DELLE REAZIONI
PUO’ DARE IMPORTANTI INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE E + S EX EY EZ  E + P

4 (RAPID MIXING)

5 Tecniche di mescolamento rapido:
Il metodo del flusso continuo (1923 – H. Hartridge and F.J.W. Roughton) 1 ms 10 m/s 1 cm Tempo morto (dead time) Tempo massimo (upper time limit)

6 Spettrofotometro a flusso continuo
Tempo morto = 45 s Tempo massimo = 1 ms)

7 Spettrofotometro a flusso interrotto
Il metodo del flusso interrotto 1934 – F.J.W. Roughton 1940 B. Chance L Spettrofotometro a flusso interrotto Tempo morto = 2 ms Tempo massimo = NO

8 Il metodo del flusso “smorzato” chimicamente

9 Flash photolysis 1959 Q.H. Gibson
Flash at 347 nm ATP “ingabbiato”

10 Tecniche di rilassamento:
Salto di temperatura o di pressione Rate constant = 1/relaxation time (0.721)

11 Tecniche di rilassamento:
Perturbazioni sinusoidali dell’equilibrio tramite ultrasuoni

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13  = kon koff [S]>>[E]

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16 E + S EX EZ  E + P

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19 STOPPED-FLOW DIODE ARRAY

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21 SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione. E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici. Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un particolare enzima. CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli) { CONTINUI SAGGI DI ATTIVITA’ DISCONTINUI o A PUNTI FISSI In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di rado misuriamo il consumo di substrato.

22 E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo
SAGGI CONTINUI Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui Per lo più usano metodi spettrofotometrici SAGGI DIRETTI E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo) Esempio: + NADH Piruvato Lattato Deidrogenasi (LDH) + NAD+ Lattato

23 E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente)
SAGGI ACCOPPIATI E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E2 + P  E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) L-treonina aldolasi Esempio: + L-treonina glicina acetaldeide alcol deidrogenasi + NADH + NAD+ acetaldeide alcol etilico

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25 [Etot] = 0,13 mM Vmax = 26  0,3 mM min-1 KM = 0,19  0,01 mM kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1

26 SAGGI DISCONTINUI Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del saggio. Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto (o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC, saggi biologici o immunologici. Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovuta alle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.

27 ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI
PRELIEVO DI ALIQUOTE AD INTERVALLI DI TEMPO ENZIMA + SUBSTRATO REAZIONE IN CORSO La reazione viene bloccata con acido, denaturanti delle proteine, calore, inibitori dell’enzima Il prodotto di reazione viene quantificato con vari metodi E1 + S  E1 + P P-X metodi colorimetrici Quantificazione con HPLC Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo 1a FASE 2a FASE X E2 Metodi radioisotopici

28 Esempio: 1a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) aminolevulinato (ALA) 2a FASE GSA + DMBA     COMPOSTO COLORATO

29 Metodi radioisotopici
Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti Esempio: misura dell’attività di un’aminotrasferasi + 1a FASE Miscela di reazione lavaggio eluizione Conteggio radiattività 2a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radiattività) colonna cromatografica a scambio anionico aminoacidi chetoacidi

30 { { INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI REVERSIBILE IRREVERSIBILE E + P1 
COMPETITIVA INCOMPETITIVA MISTA REVERSIBILE { ASPECIFICA PER IL TIPO DI ENZIMA BASATA SUL MECCANISMO DI REAZIONE DELL’ENZIMA (inibitori suicidi) IRREVERSIBILE E + P1  E + I EI    E + P2 EX EY

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34 La parete batterica contiene D-aminoacidi (D-alanina ad es
La parete batterica contiene D-aminoacidi (D-alanina ad es.) come costituenti dei ponti polipeptidici che connettono le catene di carboidrati. Questi vengono ottenuti dagli L-aminoacidi tramite reazioni di racemizzazione (catalizzate da racemasi). In alcuni batteri, il D-glutammato che viene incorporato nella parete batterica non è sintetizzato per racemizzazione ma tramite una reazione di transaminazione: D-alanina + a-chetoglutarato  piruvato + D-glutammato Questa reazione è catalizzata da un enzima dipendente dal piridossal fosfato: la D-aminoacido aminotrasferasi

35 + E-PLP + INTERMEDIO AMINOACRILATO D-b-cloroalanina (inibitore)
Il Cloro è un buon gruppo uscente nelle reazioni di sostituzione nucleofila + E-PLP D-alanina (substrato naturale) INTERMEDIO AMINOACRILATO Verso l’inibizione + Normale reazione di transaminazione

36 MECCANISMO DI INATTIVAZIONE
INTERMEDIO AMINOACRILATO ENZIMA INATTIVATO

37 La VIGABATRINA: un farmaco contro l’epilessia.
L’acido g-aminobutirrico (GABA) è uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del sistema nervoso centrale glutammato decarbossilasi L-glutammato GABA + + GABA aminotrasferasi GABA a-chetoglutarato Succinico semialdeide L-glutammato

38 L’epilessia può essere trattata aumentando la concentrazione di GABA
nel sistema nervoso centrale. Un metodo per ottenere questo risultato è quello di inibire in modo specifico la GABA aminotrasferasi GABA 4-amino-5-esanoato VIGABATRINA La VIGABATRINA, un analogo del GABA, è un efficiente inibitore della GABA aminotrasferasi ed è attualmente utilizzata con successo nel trattamento dell’epilessia

39 MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLA VIGABATRINA
75% ENZIMA INATTIVATO 25%

40 a-difluorometilornitina
L’EFLORNITINA: un farmaco contro la malattia del sonno L’ornitina decarbossilasi è un enzima essenziale per la produzione della putrescina, un precursore delle poliamine + E-PLP ornitina a-difluorometilornitina o eflornitina + E-PLP putrescina

41 MECCANISMO DI INIBIZIONE DELL’EFLORNITINA
ENZIMA INATTIVATO