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METODI DI MISURA DELLE CINETICHE ENZIMATICHE. LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIO NON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE Allo.

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1 METODI DI MISURA DELLE CINETICHE ENZIMATICHE

2 LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIO NON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE Allo stato stazionario possiamo solo misurare il flusso in uscita o in entrata, i quali sono uguali tra loro. Possiamo comunque ottenere alcune informazioni sul meccanismo di reazione variando le condizioni sperimentali (dipendenza dal pH)

3 E + S EX EY EZ E + P LO STUDIO DELLA CINETICA RAPIDA DELLE REAZIONI PUO DARE IMPORTANTI INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE

4 (RAPID MIXING)

5 Tecniche di mescolamento rapido: Il metodo del flusso continuo (1923 – H. Hartridge and F.J.W. Roughton) 10 m/s 1 cm 1 ms Tempo morto (dead time) Tempo massimo (upper time limit)

6 Spettrofotometro a flusso continuo Tempo morto = 45 s Tempo massimo = 1 ms)

7 Spettrofotometro a flusso interrotto Il metodo del flusso interrotto 1934 – F.J.W. Roughton 1940 B. Chance Tempo morto = 2 ms Tempo massimo = NO L

8 Il metodo del flusso smorzato chimicamente

9 Flash photolysis 1959 Q.H. Gibson ATP ingabbiato Flash at 347 nm

10 Tecniche di rilassamento: Salto di temperatura o di pressione Rate constant = 1/relaxation time (0.721)

11 Tecniche di rilassamento: Perturbazioni sinusoidali dellequilibrio tramite ultrasuoni

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13 [S]>>[E] k off = k on

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16 E + S EX EZ E + P

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19 STOPPED-FLOW DIODE ARRAY

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21 SAGGI DI ATTIVITA ENZIMATICA Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione. E possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone lattività con substrati specifici. Possiamo determinare i parametri cinetici (K M, K cat o attività specifica) di un particolare enzima. CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli) SAGGI DI ATTIVITA { CONTINUI DISCONTINUI o A PUNTI FISSI In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di rado misuriamo il consumo di substrato.

22 SAGGI CONTINUI Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui Per lo più usano metodi spettrofotometrici SAGGI DIRETTI E + S E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo) Esempio: +NADH + NAD + Lattato Deidrogenasi (LDH) Piruvato Lattato

23 SAGGI ACCOPPIATI E 1 + S E 1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E 2 + P E 2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) Esempio: + L -treonina glicinaacetaldeide L -treonina aldolasi acetaldeide + NADH +NAD + alcol etilico alcol deidrogenasi

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25 [E tot ] = 0,13 M K M = 0,19 0,01 mM V max = 26 0,3 M min -1 k cat = V max / [E tot ] = 26 / 0,13 = 206 min -1

26 SAGGI DISCONTINUI Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo 1)Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del saggio. 2)Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto (o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC, saggi biologici o immunologici. 3)Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovuta alle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza donda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.

27 ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI ENZIMA + SUBSTRATO REAZIONE IN CORSO PRELIEVO DI ALIQUOTE AD INTERVALLI DI TEMPO La reazione viene bloccata con acido, denaturanti delle proteine, calore, inibitori dellenzima Il prodotto di reazione viene quantificato con vari metodi E 1 + S E 1 + P P-X metodi colorimetrici Quantificazione con HPLC Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo 1 a FASE 2 a FASE X E2E2 Metodi radioisotopici

28 Esempio: 1 a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) 5-aminolevulinato (ALA) 2 a FASE GSA + DMBA COMPOSTO COLORATO

29 Metodi radioisotopici Si basano sullutilizzo di forme radiomarcate di un substrato Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti Esempio: misura dellattività di unaminotrasferasi a FASE 2 a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radiattività) Miscela di reazione colonna cromatografica a scambio anionico lavaggio Conteggio radiattività eluizione aminoacidichetoacidi

30 INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI REVERSIBILE { COMPETITIVA INCOMPETITIVA MISTA IRREVERSIBILE { ASPECIFICA PER IL TIPO DI ENZIMA BASATA SUL MECCANISMO DI REAZIONE DELLENZIMA (inibitori suicidi) E + I EI E + P 1 E + P 2 EXEY

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34 La parete batterica contiene D -aminoacidi ( D -alanina ad es.) come costituenti dei ponti polipeptidici che connettono le catene di carboidrati. Questi vengono ottenuti dagli L -aminoacidi tramite reazioni di racemizzazione (catalizzate da racemasi). In alcuni batteri, il D -glutammato che viene incorporato nella parete batterica non è sintetizzato per racemizzazione ma tramite una reazione di transaminazione: D -alanina + -chetoglutarato piruvato + D -glutammato Questa reazione è catalizzata da un enzima dipendente dal piridossal fosfato: la D -aminoacido aminotrasferasi

35 D -alanina (substrato naturale) D - -cloroalanina (inibitore) + E-PLP Il Cloro è un buon gruppo uscente nelle reazioni di sostituzione nucleofila Normale reazione di transaminazione Verso linibizione + INTERMEDIO AMINOACRILATO

36 E E E ENZIMA INATTIVATO MECCANISMO DI INATTIVAZIONE INTERMEDIO AMINOACRILATO

37 La VIGABATRINA: un farmaco contro lepilessia. Lacido -aminobutirrico (GABA) è uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del sistema nervoso centrale L -glutammatoGABA ++ L -glutammato -chetoglutarato Succinico semialdeide glutammato decarbossilasi GABA aminotrasferasi

38 Lepilessia può essere trattata aumentando la concentrazione di GABA nel sistema nervoso centrale. Un metodo per ottenere questo risultato è quello di inibire in modo specifico la GABA aminotrasferasi La VIGABATRINA, un analogo del GABA, è un efficiente inibitore della GABA aminotrasferasi ed è attualmente utilizzata con successo nel trattamento dellepilessia GABA4-amino-5-esanoato VIGABATRINA

39 MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLA VIGABATRINA 75% 25% ENZIMA INATTIVATO

40 LEFLORNITINA: un farmaco contro la malattia del sonno Lornitina decarbossilasi è un enzima essenziale per la produzione della putrescina, un precursore delle poliamine + E-PLP ornitina putrescina -difluorometilornitina o eflornitina

41 MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLEFLORNITINA ENZIMA INATTIVATO


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