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Meccanismi dazione del fitocromo Regolazione espressione genica: -Componenti del photosynthetic machinery sono regolati dalla luce, spesso tramite Phy.

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1 Meccanismi dazione del fitocromo Regolazione espressione genica: -Componenti del photosynthetic machinery sono regolati dalla luce, spesso tramite Phy -Attivazione di geni targets, mediante interazione con TFs, quali PIF3, HY5, DOF... R FR dark light Percezione segnale Trasduzione segnale Network trascrizionale Variazioni espressione Fotomorfogenesi

2 I Pathways attivati da phyA/B Identificazione delle molecole poste a valle di phyA/B: approccio genetico approccio cellulare/biochimico Approccio Genetico screening per mutanti nel/i fitocromo/i e nel signalling del/i fitocromo/i Ùidentificazione di 2 classi di mutanti: cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca) hy (long hypocotyl)

3 cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca): hy (long hypocotyl): LUCEBUIO wt copwtcop LUCE wt hy

4 cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca): mutanti deeziolati anche se cresciuti al buio, risposte al segnale luminoso costitutivamente accese mutazioni recessive le proteine Wt sono regolatori negativi che agiscono al buio x reprimere la fotomorfogenesi hy (long hypocotyl): fenotipo alla luce plantula cresciuta al buio, risposte al segnale luminoso ridotte o nulle Ê Mutanti nel cromoforo: ipocotile allungato in luce W ipocotile allungato in condizioni di luce -specifiche Ë Mutanti in uno specifico fitocromo: ipocotile allungato in luce W ipocotile allungato in condizioni di luce -specifiche Ì Mutanti in un regolatore positivo (hy5): ipocotile allungato in luce W, R. FR, blu

5 Effetti fenotipici delle mutazioni cop/det Fenotipo al buio Germinazione Phy-mediated Lungh.ipocotile Espansione cotiledoni Sviluppo foglie Differenz. Cloroplasti Accumulo antociani Induzione geni luce-regolati Fenotipo alla luce Fioritura Altezza pianta + - ? + + lungo corto corto corto corto normale normale ritardato anticipato letale normale nano nano nano max4 fog. WT det1 det2 cop1 cop9

6 Fattori nucleari coinvolti nel pathway fitocromo COP1: funziona da E3 ubiquitin-protein ligasi, targeting proteine specifiche per la degradazione mediante ubiquitinazione. Agisce come repressore, antagonista di HY5 COP9: signalosome complex (11 fattori) responsabile della degradazione di proteine ubiquitinate HY5: bZip TF, target 1°ario di questo pathway; lega le G-box sui promotori luce-regolati. Il livello steady-state del suo mRNA è mantenuto basso al buio mediante ubiquitinazione (COP1) e azione del complesso COP9 DET2: putativo fattore di remodeling della cromatina DET1: elemento di biosintesi dei Brassinosteroidi, ormoni steroidei vegetali, che mimano parte degli effetti mediati dalla luce

7 PIF3: fattore di trascrizione bHLH, localizzato costitutivamente nel nucleo, lega in modo luce-dipendente e Phy-dipendente, i promotori di geni luce regolati interagisce sia con PhyA che con PhyB, ma linterazione è 10x > con PhyA poc1: mutante knock-on nel promotore di PIF3, aumentata risposta a luce R PIF4: altro fattore di trascrizione, PIF3-like, interagisce con PhyB Pfr

8

9 Regolazione intercellulare phy-mediata: -Alcune risposte di crescita/sviluppo sono molto rapide e probabilmente mediate da variazioni inter-intracellulari di ioni/metaboliti (meccanismo citosolico di crescita/omeostasi) Meccanismi dazione del fitocromo

10 Single-cell assays: Microiniezione in cellule WT & del mutante aurea (phyA -, tomato) Aurea manca di PhyA attivo mentre PhyB è normale Cellule dellipocotile di aurea non sviluppano cloroplasti ne antociani in risposta alla luce a differenza del WT Mutante aurea complementato da microiniezione di PhyA esogeno: sviluppo cloroplasti, sintesi antociani e induzione di un gene reporter fotoregolato (Pr.light/GUS) Approccio Cellulare-Biochimico

11 Reazioni controllate da Phy a livello cellulare: Regolazione genica Sviluppo dei cloroplasti (PSII, PSI) Biosintesi degli antociani Agonisti: GTP S (GTP analogo), subunità A di cholera toxin (GTP analogo), 8Br-cGMP (cGMP analogo), Calcium, CaM Antagonisti: GTP S, Rp-8Br-cGMPS

12 cGMP attiva espressione di chs in cellule WT al buio ATP syn Cyt.b6f Luce (ore) cab fnr atp rieske rbcS chs PSII antho PSI stroma Complessi fotosintetici Dark 8Br-cGMP Rp-8Br-cGMPS - Analogo cGMP attivo Analogo cGMP inattivo

13 phyA PSII Cyt.b6f Ca 2+ CGMP G CaM Anthocyanin (chs) PSI LHCI/II ATPsynth. RUBISCO Choloroplast development G: heterotrimeric G proteins, switch molecolari che cambiano conformazione da una forma attiva GTP-legata ad una GDP-legata inattiva

14 Il sistema agisce modulando lespressione di geni a livello nucleare Ü FTs attivati da Ca2+, caM, cGMP, i due segnali sono generati separatamente i targets dei 2 pathways sono geni distinti anche i prodotti finali (outputs) sono distinti

15 Pfr Ca 2+ G protein Pr PK pathway Pfr Pfr* DET/COP PIF3 LIGHT PKS


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