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I Microarray: Una nuova tecnologia Sara Loddo 13.10.2008.

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Presentazione sul tema: "I Microarray: Una nuova tecnologia Sara Loddo 13.10.2008."— Transcript della presentazione:

1 I Microarray: Una nuova tecnologia Sara Loddo

2 Background Elevata risoluzione, ma lanalisi diventa locus-specifica Visione dinsieme dellintero genoma, ma bassa risoluzione ~3-10Mb Anni 70 ~40-100kb Anni 90 XXI secolo cariotipo molecolare

3 Tecniche diagnostiche MICROSCOPIA OTTICA: osservazione diretta dei cromosomi bandeggiati con colorazione Giemsa. Limite di risoluzione di 5-10 Mb. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization): sonde sito-specifiche, marcate con fluorescenza. Necessarie informazioni a priori sulla localizzazione del riarrangiamento. CGH (Comparative Genomic Hybridization): ibridazione competitiva di DNA genomico di un paziente e di un controllo, frammentati e marcati con un fluorocromo diverso, su metafasi di un soggetto sano.

4 Due DNA (test e controllo) marcati con due fluorocromi diversi vengono messi in competizione per il legame con le metafasi di un soggetto normale Metafase individuo normale DNA controllo DNA test CGH: Comparative Genomic Hybridization

5 1. Normale: si lega tanto DNA verde quanto DNA rosso.Il rapporto dellintensità della fluorescenza nei 2 colori è pari a Duplicazione: si lega più DNA verde del DNA rosso.Il rapporto dellintensità della fluorescenza verde/rosso è > Delezione: si lega meno DNA verde del DNA rosso. Il rapporto dellintensità della fluorescenza verde/rosso è < 1.

6 ARRAY: insieme ordinato di sequenze genomiche, la cui mappatura è nota, fissate ad un substrato solido secondo uno schema ricostruibile. Applicazioni in più campi, quali diagnostica, ricerca, farmacogenomica, etc. Utilizzate differenti tipi di sonde: BAC ( Kb), cloni di cDNA ( Kb), prodotti di PCR (100 bp- 1.5 Kb), oligonucleotidi (25-80 nt), SNPs (25 nt) La risoluzione dipende dalla lunghezza delle sequenze e dal numero degli spot Vantaggio: analisi di più geni o dellintero genoma in un singolo esperimento.

7 DNA microarray: una collezione di microscopiche sonde (probe) Ordinate Miniaturizzate Immobilizzate su una superficie solida I probe possono essere attaccati al substrato mediante: -Legame diretto, fisico o chimico -Legame indiretto, mediante molecole linker

8 1.Microarray spottati roboticamente: probe di DNA a singolo filamento pre-sintetizzati sono fissati su vetrini mediante apparecchiature automatizzate (Tecnologia Ink-Jet Printing) 2.Array di oligonucleotidi ad alta densità: set di oligonucleotidi sono sintetizzati in situ su un supporto di vetro mediante un processo di fotolitografia associata alla sintesi chimica degli oligonucleotidi (Tecnologia Affymetrix). Due tecniche di produzione di microarray

9 Microarray a DNA spottato Prima dello spottaggio, il vetrino deve essere trattato in modo che esponga sulla superficie molecole con cariche positive (Es. polilisina). Le molecole di DNA che vengono depositate sul vetrino durante lo spottaggio, vengono successivamente UV- crosslinkate alle cariche positive del vetrino.

10 Microarray di oligonucleotidi ad alta densità Fotolitografia Processo di sintesi di luce- diretta in cui linker sintetici modificati con gruppi protettivi, rimuovibili mediante la luce, sono attaccati alla superficie del vetrino. La luce viene diretta attraverso una maschera per deproteggere e attivare i gruppi selezionati. Nucleotidi protetti possono così accoppiarsi ai siti attivati. La luce viene diretta attraverso una maschera per deproteggere e attivare i gruppi selezionati. Nucleotidi protetti possono così accoppiarsi ai siti attivati.

11 E possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm 2 Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identici Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) è presente un oligo identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM) La presenza di un MM consente di stimare legami aspecifici e background locale e di sottrarli dal segnale di PM

12 Ibridazione basata sul principio di complementarietà delle basi Ibridazione competitiva : il DNA di un campione e di un controllo vengono marcati con due fluorocromi differenti (Cy3 e Cy5) ed uniti in una miscela ibridata poi sullarray. La fluorescenza è rilevata da uno scanner e il rapporto dei due segnali analizzato mediante un software. Ibridazione assoluta : su ogni array è ibridato un singolo campione marcato in maniera indiretta (biotina legata al composto fluorescente streptavidina-ficoeritrina). La fluorescenza è rilevata da uno scanner e un software analizza lintensità del segnale rosso assoluto.

13 Principali applicazioni dei microarray cDNA microarray : per misurare i livelli di espressione di determinati geni microarray SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e array di mutazione: per la genotipizzazione e identificazione di polimorfismi (SNPs) in una popolazione. microarray CGH (Comparative Genomic Hybridization): per osservare perdite o guadagni di materiale genomico o un cambiamento nel numero di copie di un gene particolare coinvolto in una malattia.

14 Microarray Genomici basati su: Sonde BAC (Bacterial Artificial Chromosome)- lunghezza di Kb, copertura omogenea del genoma, ma risoluzione bassa con difficoltà di individuazione delle piccole aberrazioni sotto le 50 Kb Cloni di cDNA- utilizzati soprattutto per lo studio dellespressione genica, offrono una più alta risoluzione ma che risulta ineguale lungo il genoma (i geni non sono distribuiti in maniera omogenea) Prodotti di PCR- offrono una maggiore risoluzione ed una più omogenea copertura, ma il segnale è basso e i costi di produzione molto alti Microarray di nuova generazione

15 (Tecnologia Ink-Jet)(Tecnologia Affymetrix) Sonde oligonucleotidiche lunghe fino a 60 nt a singolo filamento Risoluzione fino a Kb Ibridazione competitiva con un unico DNA di controllo Copertura omogenea dellintero genoma 20 sonde per ogni SNP, lunghe 25 nt, diverse per la posizione del nucleotide polimorfico Risoluzione fino a 5 Kb Ibridazione del solo DNA da testare e successivo confronto con DNA di riferimento (HapMap Project) Copertura non omogenea dellintero genoma In campo diagnostico è necessaria una conferma mediante altre tecniche (FISH o Real Time PCR) ARRAY BASATI SU OLIGONUCLEOTIDI

16 International HapMap Project Progetto iniziato nel 2002 Si propone di catalogare le varianti comuni del DNA umano in una Mappa degli Aplotipi Analizzati 270 soggetti provenienti da differenti gruppi etnici 1- Sono stati identificati polimorfismi di un singolo nucleotide (SNPs) in diversi individui 2- SNPs vicini lungo il DNA vengono ereditati insieme e formano un APLOTIPO 3- Gli SNPs identificati in un aplotipo sono caratteristici unicamente per quellaplotipo, perciò mediante genotipizzazione di 3 SNPs si può risalire allaplotipo delindividuo

17 Oligonucleotide-Array (Agilent) Gain Loss No change Fino a 244,000 sonde oligonucleotidiche Risoluzione di Kb Intensita di fluorescenza è rilevata dallo scanner Dati elaborati da un software

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19 SNPs-array (Affymetrix GeneChip 250K) 250,000 SNPs Risoluzione di 5 Kb Intensità di segnale rilevata da uno scanner e i dati elaborati da un software

20 Risoluzione di 0.7 Kb 1.8 milioni SNPs e oligonucleotidi che coprono regioni povere di SNPs combinati insieme Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 Maggiore copertura del genoma

21 Copy Number Variations (CNVs) Segmenti di DNA con estensione maggiore di 1 Kb presenti nel genoma con un numero variabile di copie. Contribuiscono: alle differenze fenotipiche tra gli individui alla patogenesi di malattie, sia mendeliane che multigeniche

22 La frequenza delle CNVs nella popolazione è di 1/800 bp Contribuiscono: Alle differenze nellespressione genica coinvolgendo sequenze vicine a geni Alla predisposizione di alcune malattie CNVs polimorfiche

23 CNVs patologiche Si devono considerare: Posizione sul cromosoma Evento de novo o ereditato Dimensione Contenuto genico Tipo di CNV (delezione o duplicazione) Per CNVs de novo: La complessità del genoma rende difficile stabilire la natura delle CNVs Sindromi genomiche mendeliane e da geni contigui associate a CNVs

24 Vissers et al. (2004) Nat Genet 36: Mutations in a new member of the chromodomain gene family cause CHARGE syndrome. Elevata sensibilita nellidentificare geni-malattia: incidenza: 1/12000 Coloboma Heart anomaly Atresia (choanal) Retardation Genital Ear anomalies

25 Sequenziamento geni in pazienti non sbilanciati Sequenziamento geni in pazienti non sbilanciati mutazioni in CHD7 (rimodellamento cromatina) Analisi array- CGH : 1 paziente con delezione di 5 Mb in 8q12 1 paziente con t(6;8): due delezioni non contigue in 8q12

26 Analisi mediante array-CGH su tutto il genoma Individuazione di una delezione in 8q12 di 5Mb Analisi del contenuto genico e sequenziamento del gene CHD7 nei pazienti che non presentano sbilanciamenti Individuazione di una mutazione nel gene CHD7 nel cromodominio della proteina coinvolta nel rimodellamento della cromatina

27 BIBLIOGRAFIA Carter NP (2007) Nat Genet 39:16-21 Methods and strategies for analyzing copy number variation using DNA microarrays. International HapMap Consortium (2005) Nature 437: A haplotype map of the human genome. Vissers et al. (2004) Nat Genet 36: Mutations in a new member of the chromodomain gene family cause CHARGE syndrome. Risorse on-line


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