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Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene. Struttura della Cromatina.

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Presentazione sul tema: "Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene. Struttura della Cromatina."— Transcript della presentazione:

1 Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene. Struttura della Cromatina nel promotore. Ruolo del nucleosoma nel bloccare laccesso al promotore. I nucleosomi possono essere spostati?

2 Fibre di Cromatina Fibra cromatinica da 30nm Fibra cromatinica da 10nm (collana di perle) + Istoni core altamente acetilati (specialmente H3 ed H4) N-Termini carichi (legano il DNA di nucleosomi adiacenti) Alti livelli di istone H1 Trascrizione OFF Ridotti livelli di istone H1 Trascrizione ON

3 DOMINI CROMATINICI EUCROMATINA: Cromatina decondensata, trascrizionalmente attiva. Replicazione precoce. Iperacetilazione degli istoni Ricca in metH3K4, 36 e 79 Geni eucromatici sottoposti a silenziamento sono ricchi in: meH3K9, 3meH3K27, meH4K20

4 ETEROCROMATINA: Cromatina altamente compattata e silenziata trascrizionalmente. Replicazione tardiva. Ipoacetilazione degli istoni Alti livelli di metilazione. Costitutiva: adiacente al centromero e contenente grandi blocchi di ripetizioni Alpha Satellite nelluomo (Major Satellite repeats in topo) Silenziata irreversibilmente Ricca in 3meH3K9 + meH3K27 + 3meH4K20 Facoltativa: E silenziata reversibilmente e può tornare ad essere attiva (Esempio: cromosoma X femminile) Ricca in 2meH3K9 + 3meH3K27 + meH4K20

5 Relazione tra stato della cromatina ed espressione genica Regola generale: Lorganizzazione nucleosomale nelle regioni a monte dei geni è correlata negativamente con lespressione dei geni a valle. Lattivazione genica si correla di solito con una riduzione delloccupanza nucleosomale nei promotori. Studi di Epigenetica hanno dimostrato anche il contrario. La cromatina può adottare diverse conformazioni con proprietà biochimiche e biofisiche distinte. Regioni genomiche diverse mostrano differenze nella compattezza globale e nellaccessibilità ad enzimi modificanti.

6 Studi fatti sulla frazione di cromatina aperta isolata da cellule e analizzata con microarrays hanno mostrato che: 1)Esiste una correlazione tra cromatina aperta e densità genica es.: sui cromosomi 17, 19 e 22, più ricchi di geni e di cromatina aperta, si forma un loop decondensato nel nucleo interfasico MA 2) Non cè sempre correlazione tra stato aperto della cromatina e livelli di espressione genica I GENI POSSONO A VOLTE ESSERE ATTIVI NELLE REGIONI CONDENSATE E INATTIVI NELLE REGIONI DECONDENSATE

7 I siti ipersensibili alla DNasi I sono circa 100 volte più sensibili a questo enzima di un normale sito cromatinico Quasi ogni gene attivo contiene un tale sito di ipersensibilità, a volte più di uno, nella regione del promotore In SV40 si ha uninterruzione nellorganizzazione nucleosomica visibile al microscopio elettronico di circa 350bp che corrisponde alla regione di ipersensibilità HS = Siti di ipersensibilità alla DNasi I

8 SITI IPERSENSIBILI ALLA DNasiI Possono rappresentare: Regioni occupate contemporaneamente da istoni e fattori di trascrizione – MMTV Regioni dove gli istoni sono stati rimossi dal DNA- geni per la β-globina, SV40

9 Problema importante: Come avviene lesclusione dei nucleosomi dalle regioni Ipersensibili? Ipotesi: Il sito ipersensibile viene riconosciuto da proteine specifiche che escludono la formazione del nucleosoma

10 Come si dimostra che i nucleosomi sono esclusi da una regione? Mappatura di siti ipersensibili alla DNasi I DNA nudo Si usano quantità molto piccole di DNAsi I in modo da avere solo circa un taglio per molecola Questo permette di tagliare solo il DNA nudo e non quello nucleosomale. La cromatina viene poi deproteinizzata Nuclei isolati RI Taglio con EcoRI, elettroforesi e blot. Sonda

11 Domini cromosomici definiti tramite la DNAsi I Eritrociti di pollo (cellule adulte): Un gene diventa suscettibile allenzima nei tessuti in cui è maggiormente espresso. Lipersensibilità definisce uno stato di predisposizione alla trascrizione.

12 Gli esperimenti con la DNasiI hanno permesso di definire e provare Lesistenza di DOMINI intesi come unità di trascrizione funzionali (che contengono geni attivi).

13 Tipicamente siti di ipersensibilità alla DNasi I sono riscontrati su sequenze regolative come gli ENHANCER e i PROMOTORI, ma anche su altri elementi più complessi LCR ISOLATORI Questi elementi delimitano e definiscono dei domini funzionali e presentano ipersensibilità piuttosto estesa alla DNasi I (a volte su regioni di parecchie Kb).

14 LCR: Locus Control Region LCR: è un cluster di siti ipersensibili alla DNAsi I scoperto nel locus genico delle β-globine e necessario per la loro espressione. Scoperto a causa dellinattivazione di transgeni (globine) che mancano di queste sequenze. Tutti i siti devono essere presenti per lattivazione, ma il loro effetto è cooperativo, la delezione di ognuno riduce debolmente la trascrizione del locus. Ogni gene è poi regolato ulteriormente dai propri controlli specifici, e questo dipende dai fattori di trascrizione gene-specifici di volta in volta attivi. La sua delezione ripristina la resistenza alla DNAsi I. Probabilmente funziona rendendo la cromatina di questa regione più aperta.

15 LOCUS CONTROL REGION (LCR) E un sito regolatore di legame al DNA lontano dal promotore indipendente dallenhancer. Di solito lega sia fattori ubiquitari che tessuto specifici. Nel locus delle globine ogni sito HS contiene lo stesso tipo di siti di legame per gli stessi fattori di trascrizione. Rende un promotore attivo a prescindere dalla sua posizione nella cromatina. Funziona aprendo la struttura nucleosomale del promotore, in modo che i fattori possono legarsi. Parecchi loci presentano elementi LCR a delimitare i loro confini: -globine umane, di pollo e di topo Locus Th2 delle citochine umane Locus GH (growth hormone; comprende GHN, CSA, CSB, CSL e GHV)

16 LCR funziona attraverso una specifica organizzazione cromatinica che viene stabilita durante la replicazione. E necessario che LCR sia in continua comunicazione con gli elementi regolativi del cluster, cioè con gli enhancer e promotori dei singoli geni E probabile che questo assetto cromatinico si formi quando ha luogo il differenziamento della linea eritroide. Il meccanismo prevede lancoraggio a proteine del nucleoscheletro. Probabilmente questo avviene tramite fattori che legano LCR e contemporaneamente fattori che legano gli enhancer dei singoli geni (GATA e motivi di legame CACC). Gli elementi regolativi vengono tutti ancorati e le sequenze interposte formano anse con un meccanismo diverso da quello che riguarda le anse formate sulla matrice nucleare. RF = Replication Factory

17 Come funziona lelemento LCR ? LCR Acetylase Pol II Una delle possibilità è che siano coinvolti sistemi di rimodellamento della cromatina, associati ai punti di ancoraggio delle anse

18 In topo: NF-E2 e GATA-1 reclutano CBP (CREB-binding protein- acetiltrasferasi) sullLCR Si ha acetilazione sullLCR e a valle fino al distale 3HS1 32Kb In human Pit1- attivatore trascrizionale del locus presente su LCR e su promotore. Delezione di Pit1 porta a forte riduzione dellacetilazione e dellespressione di GHN

19 Tecniche recenti hanno mostrato la stretta associazione spaziale tra i siti HS e i geni trascritti Si tratta di unassociazione dinamica dipendente dallo stadio dello sviluppo Struttura cromatinica predisposta Struttura cromatinica attiva ACH Fattori della linea eritroide contribuiscono alla formazione della struttura ACH EKLF (Erythroid kruppel-like factor) GATA-1 FOG-1 (friend of GATA)

20 predisposta in tutte le cellule della linea T predisposta solo in cellule T mature ed NK Nel caso del locus Th2 sono i promotori a realizzare la struttura ad ansa. I fattori GATA-3 e STAT6 sono responsabili di questa struttura

21 Gli Isolatori: scs-scs – specialized chromatin structures Sono elementi che posti tra un enhancer e un promotore impediscono allenhancer di agire sul promotore. Si può dire che delimitano un dominio. Lisolatore di Hsp70 in Drosophila lega un fattore BEAF-32 (di cui esistono due isoforme, A e B, prodotte per splicing alternativo) che viene evidenziato nelle interbande dei cromosomi politenici. Unaltra proteina che lega scs è SBP, sia in vitro che in vivo. Anche il sito HS4 dei geni della -globina di pollo è un isolatore. Hanno azione direzionale (vedi il trasposone gipsy di Drosophila). Posti tra un gene attivo e leterocromatina schermano il gene dallazione silenziatrice delleterocromatina.

22 Proteine che agiscono sullIsolatore gypsy su(Hw): mutazioni in questo gene aboliscono la capacità isolativa. Lisolatore di gipsy contiene 12 siti di legame per su(Hw). mod(mdg4): mutazioni di questo gene aumentano lefficienza dellisolatore, ma esso perde la direzionalità. Interagisce con su(Hw) e impone direzionalità alla capacità di su(Hw) di svolgere la funzione isolatrice.

23 Modelli di isolamento Il modello dei domini lega lorganizzazione fisica del cromosoma con le caratteristiche funzionali dellisolatore. Lisolatore delimita un dominio che favorisce linterazione produttiva di elementi allinterno del dominio ma preclude linterazione con elementi al di fuori di esso.

24 Trascrizione della cromatina Unidea su come possa funzionare: Girando intorno a un DNA-loop Studitsky, Clark, Felsenfeld Cell 76, 371 (1994)

25 Il Nucleosoma può bloccare laccesso allapparato trascrizionale Esperimenti di Roeder mostrano che il nucleosoma può bloccare TBP, fattori e polimerasi II. DNA usato è quello di Adenovirus. Nucleosomi aggiunti prima di TFIID, fattori e pol II TATA + Nessuna trascrizione II TATA Fattori e pol II aggiunti prima, poi gli istoni TATA + Trascrizione II TATA Questo può avvenire in seguito alla replicazione

26 Questo è stato chiamato MODELLO DELLACCAPARRAMENTO In un altro esperimento in vitro: DNA 5S + TFIIIA TRASCRIZIONE Successiva aggiunta di ottameri istonici NON spiazza il fattore di trascrizione DNA 5S + ISTONI + TFIIIA NESSUNA TRASCRIZIONE

27 ESISTE ANCHE UN MODELLO DINAMICO Anche questo modello è formulato sulla base di esperimenti in vitro. PROMOTORE DI Hsp70 di Drosophila DNA + fattore GAGA Nel promotore inizialmente nucleosomizzato, appare una regione di ipersensibilità alle nucleasi. QUESTO AVVIENE ANCHE DOPO LA FORMAZIONE DEI NUCLEOSOMI LA REGIONE DI IPERSENSIBILITA (probabilmente più libera dai nucleosomi) METTE IN FASE I NUCLEOSOMI ADIACENTI

28 STABILITA DEI SITI IPERSENSIBILI ALLA DNAsiI FIBROBLASTI DI POLLO TRASFORMAZIONE CON UN VIRUS ts CRESCITA A TEMPERATURA PERMISSIVA espressione delle globine comparsa dei siti ipersensibili PASSAGGIO A TEMPERATURA NON PERMISSIVA disattivazione delle globine i siti ipersensibili permangono per circa 20 generazioni e poi scompaiono Esistono meccanismi per linstaurazione dellipersensibilità e per il suo mantenimento?

29 Analisi sulla struttura nucleosomale su larga scala in lievito ha rivelato Numerose ORF e promotori di geni repressi hanno nucleosomi ben posizionati. Quasi tutti i geni hanno DHS (siti ipersensibili alla DNasi) nei promotori a prescindere dallo stato trascrizionale dei geni stessi. LA PRESENZA DI DHS RIFLETTE COMPETENZA TRASCRIZIONALE PIU CHE ATTIVITA TRASCRIZIONALE


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