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STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI DottorandaStefania Luppi Dottoranda Stefania.

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Presentazione sul tema: "STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI DottorandaStefania Luppi Dottoranda Stefania."— Transcript della presentazione:

1 STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI DottorandaStefania Luppi Dottoranda Stefania Luppi XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile, Pediatria dello Sviluppo e dellEducazione, Perinatologia 29 Settembre 2008 Relazione I anno

2 APOPTOSI Morte cellulare programmata Fagocitosi corpi apoptotici SENZA infiammazione Ruolo essenziale nel CONTROLLO NUMERO CELLULE GERMINALI Lee et al Spermatogenesi: PERDITA di circa il 75% del pot. numero di spz maturi Dunkel et al.1997 Rottura equilibrio = DIFETTI MATURAZIONE FERTILITA??

3 Individuata via di segnalazione Fas in spz EIACULATI M con parametri liquido seminale anormale:% spz Fas+ APOPTOSI ABORTIVA In alcuni casi di INFERTILITA compromissione di mecc. apoptotici durante spermatogenesi, percui Spz Fas+ NON vengono eliminati. Sakkas et al., 1999, 2002 Il SISTEMA Fas/FasL GERM CELL SERTOLI FasL Fas DD

4 Soggetti normo- e non normo-zoospermici Fas presente su membrana LEUCOCITI Dati i risultati contrastanti presenti in letteratura è da chiarire la presenza o meno di Fas su spz eiaculati

5 RIDUZIONE dellINTEGRITA di MEMBRANA Molto frequente in SOGGETTI INFERTILI Ricci et al.,2002; Glander et al.,1999 Perdita asimmetria PL di membrana Traslocazione Fosfatidil-Serina (PS) Evento PRECOCE di apoptosi ec ic FACS + PI Spermatozoi: vitali (AV-/PI-) apoptotici (AV+/PI-) necrotici (AV+/PI+) Legame AnnessinaV fluo (AV)- PS

6 Perticarari et al., 2007 lega DNA cell vive/apoptotichepenetra in cell necrotiche FACS Spermatozoi: vitali (Syto-16++) apoptotici (Syto-16+) necrotici (Syto-16-/7-AAD+) Syto-16 / 7-AAD (7-Amino-Actinomycin-D)

7 LEUCOCITI e APOPTOSI Funzione cellulare fisiologica dei leucociti, in assenza di infez., responsabili di RIMOZIONE SPZ APOPTOTICI migliorando la qualità del seme. moAb anti-CD45 FACS [ ] leuco: monociti linfociti PMN Potenziale enorme di interazioni tra leucociti e sist.riproduttivo Ruolo leucociti nel liquido seminale non ancora spiegato Correlazione LEUCOCITI spz e INDICE APOPTOTICO spz in soggetti normo- e NONnormo-zoospermici Ricci et al., 2002

8 FAGOCITOSI degli SPZ APOPTOTICI a. In mammiferi dopo INSEMINAZIONE una grande q di spz viene rimossa attraverso FAGOCITOSI da parte delle cellule del tratto genitale Suarez et al., 2002; Pandya e Cohen, 1985 b. FECONDAZIONE avviene SOLO in seguito a CAPACITAZIONE degli spz nel tratto genitale In app genitale dopo richiamo LEUCOCITI per chemotassi, inducono APOPTOSI spz post-capacitati che NON hanno fertilizzato lovocita, a cui segue la FAGOCITOSI senza reaz infiammatoria.

9 OBIETTIVI della RICERCA: 1.Studio dellAPOPTOSI degli spz, in condiz. fisiologiche e dopo capacitazione in vitro: - diversi marker dellapoptosi - in pz normo- e NONnormo-zoospermici Metodiche: AV/PI; Syto-16/7-AAD in FACS 2.Analisi del SISTEMA Fas/FasL negli spz, in condiz. basali e dopo capacitazione in vitro e nei leucociti Metodiche: moAb fluoresceinati anti-Fas in combinazione con il FACS moAb fluoresceinti anti-CD45 3.Definire il ruolo dei LEUCOCITI in rapporto allapoptosi e alla rimozione degli spermatozoi Metodica: moAb fluoresceinati anti-CD45 in FACS

10 5. Analisi del processo di FAGOCITOSI degli spz in condizioni basali e dopo capacitazione in vitro in pz normo- e NONnormo-zoospermici: - anomalie nella fagocitosi in casi di INFERTILITA di COPPIA - > suscettibilità di spz di maschi infertili ad essere fagocitati Tali informazioni fornirebbero una possibilità in più per la diagnostica delle infertilità e una possibile chiave di intervento per il loro trattamento. 4.Confermare il risultato di altri studi in cui si è dimostrato che, se indice apoptotico spz è > 40%, si riscontra < prob di gravidanza e > prob di aborti spontanei in seguito a tecniche di PMA (IUI, FIVET) …..

11 RISULTATI PRELIMINARI 1)Allestito test citometrico per verificare CAPACITA di FAGOCITOSI degli spz da parte di MACROFAGI (FACS) Risultati confermati con MICROSCOPIA OTTICA A FLUORESCENZA Phrodo succinimydil ester 2)Suscettibilità spz ad essere fagocitati PRIMA e DOPO CAPACITAZIONE in vitro Fagocitosi può favorire RIMOZIONE spz meno efficienti Spz non colorati Spz non cap pHrodo Spz cap pHrodo

12 3)Differenza dovuta a espressione di molecole di spf come C1q (macrofagi) e C1qR (spz) AMPLIARE CASISTICA per verificare se questa differenza è correlata a fagocitosi da parte dei macrofagi e comprendere se e come le 2 tecniche di capacitazione in vitro (MP e SU) possano influire su tale meccanismo. NON CAP CAP (mp) NON CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60 CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60


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