Dottorato in Medicina Materno - Infantile,

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1 Dottorato in Medicina Materno - Infantile,
Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia (XX ciclo) ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA Dottoranda: Coordinatore: Dott. ssa Fabbro Elisa Chiar. mo Prof. Alessandro Ventura Tutore e Relatore: Dott. Not Tarcisio 1

2 LA CELIACHIA Definizione di celiachia (CD):
“E’ un’enteropatia autoimmune che si manifesta in individui geneticamente predisposti in seguito al consumo di glutine.”              In particolare la frazione tossica del glutine è rappresentata dalla sua componente alcool solubile: LA GLIADINA

3 La celiachia SINTOMI E SEGNI I VILLI INTESTINALI:
Sottili filamenti situati nell’intestino tenue deputati ad aumentare la superficie di assimilazione del tubo digerente. Il danno subito dai villi porta quindi ad una riduzione di tale superficie e ad un conseguente malassorbimento di nutrienti

4 La celiachia SINTOMI GASTROINTESTINALI Diarrea cronica con steatorrea
( perdita di grassi non assorbiti con le feci) Dolori addominali, epigastralgia e dispepsia Meteorismo Vomito Spasmi addominali

5 La celiachia SINTOMI EXTRAINTESTINALI
Anemia da carenza di ferro, di acido folico e/o vit. B12 Aumento delle transaminasi Osteoporosi Infertilità / aborti Disturbi neurologici Crampi Ritardo della crescita ( nei bambini) Secchezza delle mucose

6 La celiachia PATOLOGIE ASSOCIATE Diabete mellito insulino dipendente
Tiroiditi autoimmuni Artrite reumatoide Sclerosi multipla Cardiomiopatia dilatativa Idiopatica

7 La celiachia DIAGNOSI TECNICHE NON INVASIVE TECNICHE INVASIVE
Per porre diagnosi di celiachia si seguono due diverse strade : TECNICHE NON INVASIVE TECNICHE INVASIVE

8 La celiachia DIAGNOSI Le tecniche invasive sono rappresentate da
esami strumentali: EGDS (esofagogastroduodenoscopia) E’ la metodica attualmente più usata per ottenere delle biopsie, che di solito sono multiple, a livello della seconda o terza porzione del duodeno. Soltanto la biopsia intestinale ci permette di dimostrare, attraverso l’esame istologico, la presenza delle lesioni intestinali che sono alla base della definizione di malattia celiaca

9 Test sierologici nella celiachia
DIAGNOSI Le tecniche non invasive sono rappresentate dalla diagnostica di laboratorio Test sierologici nella celiachia Sensitività % Specificita % AGA-IgG – – 90 AGA-IgA – – 95 EMA (IgA) – – 100 TTG (IgA) – – 97

10 Epidemiologia DIAGNOSI 1:5000 Diarrea, Difetto di Crescita Sintomi
1:500 – 1:250 Anemia, Bassa Statura Anticorpi anti-glutine 1:150 Malattie Autoimmuni Anticopri anti-endomisio 1:90 Programmi di “Case finding” Screening di Popolazione Anticorpi anti-transglutaminasi

11 ANTICORPI ANTI ACTINA: nuovi marker sierologici nella celiachia
Anticorpi Anti-Actina (A.A.A.): sensibilità ( %) specificità ( 100%) Valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri ( - 20°C ) sensibilità ( 43 %)

12 Gli A.A.A. correlano con la lesione istologica della mucosa intestinale
Type Type Type Type 3 Marsh, Gastroenterology 1992 , Vol 102: Normal Celiac Diseae (latent) Infilitrative Celiac Giardiasis Milk intolerance Tropical sprue Marasmus GVHR Hyper plastic Flat destructive Marsh has described a progression of changes in the small intestinal mucosa. The earliest changes involve an increased mucosal cellular infiltrate, and in particular there is an increase in the number of intra-epithelial lymphocytes (Marsh type 1 or infiltrative stage). The next step is progressive elongation of the intestinal crypts (Marsh type II or hyperplastic stage) superimposed on the increased cellular infiltrate. The final step is progressive flattening of the intestinal villi superimposed on the cellular infiltrate and crypt hyperplasia (Marsh type III or destructive stage). While the histological changes, and in particular the Marsh type III changes, are characteristic for celiac disease they are by no means pathognomonic and may also be seen with other conditions. It is the constellation of clinical features, histological findings, response to therapy and serological findings that ultimately enable a confident diagnosis of confirmed celiac disease.

13 Obiettivi: Allestire una metodica di “immunofluorescenza indiretta”
Misurare la riproducibilità del test A.A.A. nella mucosa intestinale di un pz. con CD 13

14 Obiettivi: Gli A.A.A. in una patologia autoimmune con danno del citoscheletro : la Cardiomiopatia Dilatativa Idiopatica Confrontare gli A.A.A. con gli anticorpi anti Ttg nella CD Verificare il ruolo di fattori sierici leganti l’ Actina (A. B. P.) nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo

15 A. B. P. : proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare dell’Actina.
Cofilina Gelsolina A. B. P. sequestrano l’Actina al legame con anticorpi specifici risultati falsamente negativi •

16 Materiali e Metodi Immunofluorescenza indiretta (IFA)
Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 2004 : 102 (12 =3a, 40=3b , 48=3c); età media : 20 a. a.; sesso: 57 f., 45 m.; Controlli : 103 donatori sani 76 soggetti malati (Chron, Rettocoliti U.) Allestimento di vetrini attivati con cellule “Hep2” Trattamento fisico - chimico dei sieri Lettura al microscopio a fluorescenza Immunofluorescenza indiretta (IFA)

17 Trattamento fisico-chimico dei sieri
1 2 IgA anti-actina su cellule “Hep2.” Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero riscaldato; 3 siero in EDTA. La positività del test è evidente nei fotogrammi 2-3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1. 3 Il pre trattamento facilita 1.l’osservazione al microscopio 2.rende il test più sensibile

18 1) Risultato: Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei campioni. Pz celiaci: № =102 Cntr. sani: № =103 malati: № =76 % Positivi Sieri non Trattati (N.T.) 48 % (№ :49) 14,6 % (№:15) 18,4 % (№:14) Sieri Riscaldati ( R ) 82,4 % (№:84) 24,3 % (№:25) 48,7 % (№:37) Sieri con E.D.T.A. ( E ) 76,5 % (№:78) 13,5 % 29 % (№:22) sensibilità specificità

19 2) Risultato: Correlazione tra positività degli A.A.A. e grado di lesione istologica. Trattamento dei sieri Lesione 3a Lesione 3b Lesione 3c Non Trattato p = no sign. 4 (33.3%) 19 (47,5%) 22 (45,8%) Riscaldato p = 0,039 8 (66,7%) 31 (77,5%) 44 (91,7 %) Con EDTA p = 0,001 6 (50%) 27 (67,5%) 43 (89,6 %) La % di positivi è tanto maggiore quanto più grave è la lesione solo se i sieri sono pre-trattati

20 Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori
sensibilità NT R E 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 specificità trattamento

21 3)Risultato: Riproducibilità degli A.A.A.
Kappa Forza della concordanza < 0,00 Povera 0,00 – 0,020 Lieve 0,21- 0,40 Discreta O,41-0,60 Moderata 0,61-0,80 Sostanziale 0,81-1 Quasi perfetta Metodica del trattamento Kappa Forza di agreement Landis-Koch Riproducibilità Fleiss Non Trattato 0,59 Moderata Buona Trattamento Fisico O,61 Sostanziale Chimico 0,64 Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch Kappa Riproducibilità >0,75 Eccellente 0,40-0,74 Buona 0,00-0,039 Marginale Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss 21

22 Valore predittivo positivo (VPP): prob
Valore predittivo positivo (VPP): prob. che un individuo positivo al test abbia effettivamente la patologia in esame Valore predittivo negativo(VPN): prob. che un individuo negativo al test NON abbia effettivamente la patologia in esame Trattamento dei sieri VPP VPN Non Trattato 62,8 % 74 % Chimico (EDTA) 68,4 % 85,6 % Fisico (CALORE) 56 % 86,7 %

23 Attività inibitoria degli A .B. P.
Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina

24 Attività inibitoria di fattori sierici (A. B. P.):
Sequenza del test d’inibizione: 1. Preincubazione delle cellule con pool di sieri (A.A.A.-) 2. Incubazione con siero di celiaco pretrattato (A.A.A. +++) L’attività inibitoria del pool (A.A.A. -) viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina g ( g/ml)

25 Prove di identificazione:
4 )Risultato Prove di identificazione: Pre incubazione dello stesso pool di sieri A.A.A con l’Anticorpo anti Gelsolina (Sigma G4896)

26 5)Risultato: Confronto Ig A anti AAA- anti tTg
IgA ANTI - ACTINA IgA ANTI- tTG PZ. CELIACI (№ :102 ) NON TRATTATI TRATTAMENTO FISICO CHIMICO 100 % (№:102) 48 % (№ :49) 82,4% (№:84) 76,5 % (№:78) CONTROLLI MALATI (№ :103 ) 18,4 % (№:14) 48,7 % (№:37) 29% (№:22) 0 % (№:0) SANI (№ :76 ) 14,6 % (№:15) 24,3 % (№:25) 13,5 %

27 Anticorpi Anti Actina nella mucosa intestinale
Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di un controllo sano Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di un pz. celiaco ( 3 C, A.A.A.+ nel siero) selezione di anticorpi specifici per actina 30 anticorpi anti Actina 4 anticorpi anti Actina

28 5)Risultato: Presenza A.A.A. nella mucosa intestinale di un celiaco
RICONFERMA DELLA POSITIVITA’: Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep 2b Incubazione con anticorpi ricombinanti Lettura al microscopio a fluorescenza

29 Caratterizzazione A.A.A.
FINGERPRINTING (P.C.R., digestione enzimatico, separazione elettroforetica) P.M. A2 E5 G8 H7 A8 B12 C5 D7 D8 F8 H5 F2 B12 D5 E10 H6 D4 A7 D3 G6 H11 E9 F11

30 Sequenziamento: Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido nucleico. CLONE VH Gene V Score CDR3 B5 VH 1 DP-14/V1-18+ 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV B7 VH1 E8 2M27/11M27... 1110 EEVRPTGDSYYTGLDV C10 DP-14/V1-18 1164 H8 C8 2M27/11M27 1092 H10 VH5 VHVCW/COS-24 1263 HSDSYGSYYFDY H9 VH3 COS-6/DA-8 1281 DLRRSDY A5 VH6 DP-74/VH-VI 1236 GAPLCAL B8 EEVRPTGDSSCLV H11 A9 VHVCW/COS-24+ 1254 H2 1128 H5 1146 GLGYCDGGCQVPYSALDV C9 VH2 S12-10 1233 TGCSGDCSYYSYYGLDV E10 DP-35/V GRVSGWLPFDY A3 DP-47/V3-23.. 1182 LTSKYYHRMDV A6 DP-74/VH-VI... 628 GSYRNTWVW B11 V3-48/hv3d1 1218 DVHYGFDL F9 DP-7/ DVDGSGSFSPHSSYKYRMDV H7 VH4 VIV-4/4.35+ 1239 YNWNDAPDGYDI

31 LA CARDIOMIOPATIA DILATATIVA IDIOPATICA (CMPD)
patologia cronica e severa del miocardio caratterizzata da una ridotta funzione contrattile dei ventricoli associata a dilatazione delle camere cardiache Eziopatogenesi sconosciuta Predisposizione genetica Associazione con specifici alleli HLA II SOTTOGRUPPO DI CMPD Patologia autoimmune organo specifica Autoanticorpi riconoscono con lo specifico antigene

32 CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova associazione
6)Risultato: CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova associazione Contr. Sani: №=103 Probandi: № =63 Parenti: №=84 % Positivi 59,7 % (№:36) 21,4 % (№:18) SIERI 11,6 % (№:12) Positività degli A.A.A. in 63 pazienti con CMPD ,in 84parenti di primo grado e in un gruppo di 103 controlli sani

33 CMPD Famiglia & Autoimmunità
Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.- giallo = probando

34 Conclusioni: Il dosaggio degli anticorpi anti tTg:
Sensibilità, Specificità= 98% Significativa correlazione con la gravita’ della lesione intestinale DOSAGGIO DELLE tTg: TEST PIU’ EFFICACE NELLA DIAGNOSI DI CELIACHIA Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di una ridotta specificità (80%) TEST A.A.A. NON DEVE ESSERE UTILIZZATO NELLO SCRIINING DI CELIACHIA

35 Conclusioni Immunofluorescenza indiretta:test operatore-dipendente
CARATTERIZZATO DA UNA BASSA RIPRODUCIBILITA’ La Gelsolina sierica è una delle cause pricipali della bassa sensibilità del test DISPONIBILITA’ DI ANTICORPI ANTI ACTINA ISOLATI DA MUCOSA INTESTINALE da utilizzare controllo positivo nei test per il dosaggio degli A.A.A.

36 Obiettivi futuri: Studi prospettici per comprendere il ruolo predittivo degli A.A.A. in familiari dei soggetti con CMPD Comprendere i meccanismi patogenetici alla base dell’associazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitro Verificare il ruolo degli A.A.A. nella patogenesi del danno intestinale della CD

37 Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease screening
Available online at Clinica Chimica Acta 390 (2008) 134–137 Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease screening Elisa Fabbro, Laura Rubert, Sara Quaglia, Fortunato Ferrara,Valentina Kiren,Tarcisio Not Department of Reproductive and Development Science, University of Trieste and I.R.C.CS “Burlo Garofolo” Trieste,Italy Received 20 November 2007 ;received in revised form 15 January 2008; accepted 15 January 2008