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ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA Dottoranda: Coordinatore: Dott. ssa Fabbro Elisa Chiar. mo Prof.

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Presentazione sul tema: "ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA Dottoranda: Coordinatore: Dott. ssa Fabbro Elisa Chiar. mo Prof."— Transcript della presentazione:

1 ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA Dottoranda: Coordinatore: Dott. ssa Fabbro Elisa Chiar. mo Prof. Alessandro Ventura Tutore e Relatore: Dott. Not Tarcisio Dottorato in Medicina Materno - Infantile, Pediatria dello Sviluppo e dellEducazione, Perinatologia (XX ciclo)

2 Definizione di celiachia (CD): E unenteropatia autoimmune che si manifesta in individui geneticamente predisposti in seguito al consumo di glutine. LA CELIACHIA In particolare la frazione tossica del glutine è rappresentata dalla sua componente alcool solubile: LA GLIADINA

3 La celiachia La celiachia SINTOMI E SEGNI I VILLI INTESTINALI: Sottili filamenti situati nellintestino tenue deputati ad aumentare la superficie di assimilazione del tubo digerente. Il danno subito dai villi porta quindi ad una riduzione di tale superficie e ad un conseguente malassorbimento di nutrienti

4 La celiachia SINTOMI GASTROINTESTINALI Diarrea cronica con steatorrea ( perdita di grassi non assorbiti con le feci) Dolori addominali, epigastralgia e dispepsia Meteorismo Vomito Spasmi addominali

5 La celiachia SINTOMI EXTRAINTESTINALI Anemia da carenza di ferro, di acido folico e/o vit. B12 Aumento delle transaminasi Osteoporosi Infertilità / aborti Disturbi neurologici Crampi Ritardo della crescita ( nei bambini) Secchezza delle mucose

6 La celiachia PATOLOGIE ASSOCIATE Diabete mellito insulino dipendente Tiroiditi autoimmuni Artrite reumatoide Sclerosi multipla Cardiomiopatia dilatativa Idiopatica

7 La celiachia La celiachia DIAGNOSI Per porre diagnosi di celiachia si seguono due diverse strade : TECNICHE NON INVASIVE TECNICHE INVASIVE

8 La celiachia Le tecniche invasive sono rappresentate da esami strumentali: EGDS (esofagogastroduodenoscopia) EGDS (esofagogastroduodenoscopia) E la metodica attualmente più usata per ottenere delle biopsie, che di solito sono multiple, a livello della seconda o terza porzione del duodeno. Soltanto la biopsia intestinale ci permette di dimostrare, attraverso lesame istologico, la presenza delle lesioni intestinali che sono alla base della definizione di malattia celiaca DIAGNOSI

9 La celiachia DIAGNOSI Le tecniche non invasive sono rappresentate dalla diagnostica di laboratorio Sensitività % Specificita % Sensitività % Specificita % AGA-IgG 69 – – 90 AGA-IgA 75 – – 95 EMA (IgA) 85 – – 100 TTG (IgA) 90 – – 97 Test sierologici nella celiachia Test sierologici nella celiachia

10 Sintomi 1:5000 Anticorpi anti-glutine 1:500 – 1:250 Anticopri anti-endomisio 1:150 Anticorpi anti-transglutaminasi 1:90 DIAGNOSI DIAGNOSI DiarreaDifetto di Crescita Diarrea, Difetto di Crescita Anemia, Bassa Statura Malattie Autoimmuni Programmi di Case finding Screening di Popolazione Epidemiologia

11 ANTICORPI ANTI ACTINA: nuovi marker sierologici nella celiachia Anticorpi Anti-Actina (A.A.A.): sensibilità ( 82-25%) sensibilità ( 82-25%) specificità ( 100%) specificità ( 100%) Valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri ( - 20°C ) sensibilità ( 43 %)

12 Type 0 Type 1 Type 2 Type 3 Marsh, Gastroenterology 1992, Vol 102: Normal Celiac Diseae (latent) Infilitrative Celiac Giardiasis Milk intolerance Tropical sprue Marasmus GVHR Hyper plastic Celiac Giardiasis Milk intolerance Tropical sprue Marasmus GVHR Flat destructive Celiac Giardiasis Milk intolerance Tropical sprue Marasmus GVHR Gli A.A.A. correlano con la lesione istologica della mucosa intestinale

13 Obiettivi: Obiettivi: Allestire una metodica di immunofluorescenza indiretta Allestire una metodica di immunofluorescenza indiretta Misurare la riproducibilità del test A.A.A. nella mucosa intestinale di un pz. con CD

14 Confrontare gli A.A.A. con gli anticorpi anti Ttg nella CD Gli A.A.A. in una patologia autoimmune con danno del citoscheletro : la Cardiomiopatia Dilatativa Idiopatica Obiettivi: Verificare il ruolo di fattori sierici leganti l Actina (A. B. P.) nellinibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo

15 A. B. P. : proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare dellActina. A. B. P. : proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare dellActina. GelsolinaGelsolina CofilinaCofilina risultati falsamente negativi risultati falsamente negativi A. B. P. sequestrano lActina al legame con anticorpi specifici A. B. P. sequestrano lActina al legame con anticorpi specifici

16 Materiali e Metodi Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep2 Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep2 Trattamento fisico - chimico dei sieri Trattamento fisico - chimico dei sieri Lettura al microscopio a fluorescenza Lettura al microscopio a fluorescenza Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 2004 : Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 2004 : 102 (12 =3a, 40=3b, 40=3b, 48=3c); 48=3c); età media : 20 a. a.; età media : 20 a. a.; sesso: 57 f., 45 m.; sesso: 57 f., 45 m.; Controlli : 103 donatori sani Controlli : 103 donatori sani 76 soggetti malati (Chron, Rettocoliti U.) 76 soggetti malati (Chron, Rettocoliti U.) Immunofluorescenza indiretta (IFA)

17 1 2 3 IgA anti-actina su cellule Hep2. Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero riscaldato; 3 siero in EDTA. La positività del test è evidente nei fotogrammi 2- 3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1. Trattamento fisico-chimico dei sieri Il pre trattamento facilita 1.losservazione al microscopio 2.rende il test più sensibile

18 1) Risultato: Pzceliaci: =102 =102Cntr. sani: sani: =103 =103Cntr.malati: =76 =76 % Positivi Sieri non Trattati (N.T.) 48 % ( :49) 14,6 % (:15) 18,4 % (:14) Sieri Riscaldati ( R ) 82,4 % (:84) 24,3 % (:25) 48,7 % (:37) Sieri con E.D.T.A. ( E ) 76,5 % (:78) 13,5 % (:14) 29 % (:22) Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei campioni. sensibilità sensibilità specificità specificità

19 Correlazione tra positività degli A.A.A. e grado di lesione istologica. Trattamento dei sieri Lesione 3a Lesione 3b Lesione3c NonTrattato p = no sign. 4 (33.3%) 19 (47,5%) 22(45,8%) Riscaldato p = 0,039 p = 0,0398(66,7%)31(77,5%)44 (91,7 %) Con EDTA p = 0,001 6(50%)27(67,5%)43 (89,6 %) (89,6 %) 2) Risultato: La % di positivi è tanto maggiore quanto più grave è la lesione solo se i sieri sono pre-trattati

20 sensibilità NTRE specificità trattamento NTRE Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori

21 3)Risultato: Riproducibilità degli A.A.A. Metodica del trattamento Kappa Forza di agreement Landis-Koch RiproducibilitàFleiss Non Trattato 0,59ModerataBuona TrattamentoFisicoO,61SostanzialeBuona TrattamentoChimico0,64SostanzialeBuona Kappa Forza della concordanza < 0,00 Povera 0,00 – 0,020 Lieve 0,21- 0,40 Discreta O,41-0,60Moderata 0,61-0,80Sostanziale 0,81-1 Quasi perfetta KappaRiproducibilità>0,75Eccellente 0,40-0,74Buona 0,00-0,039Marginale Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss

22 Valore predittivo positivo (VPP): prob. che un individuo positivo al test abbia effettivamente la patologia in esame Valore predittivo negativo(VPN): prob. che un individuo negativo al test NON abbia effettivamente la patologia in esame Trattamento dei sieri dei sieriVPPVPN NonTrattato 62,8 % 74 % TrattamentoChimico(EDTA) 68,4 % 85,6 % TrattamentoFisico(CALORE) 56 % 56 % 86,7 %

23 Attività inibitoria degli A.B. P. Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina

24 Sequenza del test dinibizione: 1. Preincubazione delle cellule con pool di sieri (A.A.A.-) 2. Incubazione con siero di celiaco pretrattato (A.A.A. +++) Attività inibitoria di fattori sierici (A. B. P.) : Lattività inibitoria del pool (A.A.A. -) viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina g ( g/ml)

25 re incubazione dello stesso pool di sieri A.A.A. - con lAnticorpo anti Gelsolina (Sigma G4896) Pre incubazione dello stesso pool di sieri A.A.A. - con lAnticorpo anti Gelsolina (Sigma G4896) Prove di identificazione: 4 )Risultato

26 5)Risultato: Confronto Ig A anti AAA- anti tTg IgA ANTI - ACTINA IgA ANTI- tTG PZ. CELIACI ( :102 ) ( :102 ) NONTRATTATITRATTAMENTOFISICOTRATTAMENTOCHIMICO 100 % (:102) 48 % ( :49) 82,4%(:84) 76,5 % (:78) CONTROLLIMALATI ( :103 ) ( :103 ) 18,4 % (:14) 48,7 % (:37)29%(:22) 0 % (:0) CONTROLLI SANI SANI ( :76 ) ( :76 ) 14,6 % (:15) 24,3 % (:25) 13,5 % (:14) 0 % (:0)

27 Anticorpi Anti Actina nella mucosa intestinale selezione di anticorpi specifici per actina 30 anticorpi anti Actina 4 anticorpi anti Actina Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di un controllo sano Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di un pz. celiaco ( 3 C, A.A.A.+ nel siero)

28 5)Risultato: Presenza A.A.A. nella mucosa intestinale di un celiaco Incubazione con anticorpi ricombinanti Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep 2b Lettura al microscopio a fluorescenza RICONFERMA DELLA POSITIVITA:

29 FINGERPRINTING (P.C.R., digestione enzimatico, separazione elettroforetica) P.M. A2 E5 G8 H7 A8 B12 C5 D7 D8 F8 H5 F2 B12 D5 E10 H6 D4 A7 D3 G6 H11 E9 F11 Caratterizzazione A.A.A.

30 Sequenziamento: Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido nucleico.DNAnucleotidi CLO NE VHGene VScoreCDR3 B5VH 1DP-14/V GLGYCAGGCQVPYYALDV B7VH1DP-14/V GLGYCAGGCQVPYYALDV E8VH12M27/11M EEVRPTGDSYYTGLDV C10VH1DP-14/V GLGYCAGGCQVPYYALDV H8VH1DP-14/V GLGYCAGGCQVPYYALDV C8VH12M27/11M271092EEVRPTGDSYYTGLDV H10VH5VHVCW/COS HSDSYGSYYFDY H9VH3COS-6/DA-81281DLRRSDY A5VH6DP-74/VH-VI1236GAPLCAL B8VH12M27/11M271110EEVRPTGDSSCLV H11VH1DP-14/V GLGYCAGGCQVPYYALDV A9VH5VHVCW/COS HSDSYGSYYFDY H2VH1DP-14/V GLGYCAGGCQVPYYALDV H5VH1DP-14/V GLGYCDGGCQVPYSALDV C9VH2S TGCSGDCSYYSYYGLDV E10VH3DP-35/V GRVSGWLPFDY A3VH3DP-47/V LTSKYYHRMDV A6VH6DP-74/VH-VI GSYRNTWVW B11VH3V3-48/hv3d11218DVHYGFDL F9VH1DP-7/ DVDGSGSFSPHSSYKYRMDV H7VH4VIV-4/ YNWNDAPDGYDI

31 SOTTOGRUPPO DI CMPD Patologia autoimmune organo specifica Autoanticorpi riconoscono con lo specifico antigene LA CARDIOMIOPATIA DILATATIVA IDIOPATICA (CMPD) patologia cronica e severa del miocardio caratterizzata da una ridotta funzione contrattile dei ventricoli associata a dilatazione delle camere cardiache Eziopatogenesi sconosciuta Predisposizione genetica Associazione con specifici alleli HLA II

32 Contr. Sani:=103 Probandi: Probandi: =63 =63 Parenti: Parenti: =84 =84 % Positivi 59,7 % 59,7 % (:36) (:36) 21,4 % 21,4 % (:18) (:18) SIERI % Positivi 11,6 % (:12) 11,6 % (:12) 6)Risultato: 6)Risultato: CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova associazione CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova associazione Positività degli A.A.A. in 63 pazienti con CMPD,in 84parenti di primo grado e in un gruppo di 103 controlli sani

33 Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.- giallo = probando CMPD Famiglia & Autoimmunità

34 Conclusioni: Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di una ridotta specificità (80%) TEST A.A.A. NON DEVE ESSERE UTILIZZATO NELLO SCRIINING DI CELIACHIA Il dosaggio degli anticorpi anti tTg: Il dosaggio degli anticorpi anti tTg: Sensibilità, Specificità= 98%Sensibilità, Specificità= 98% Significativa correlazione con la gravita della lesione intestinaleSignificativa correlazione con la gravita della lesione intestinale DOSAGGIO DELLE tTg: DOSAGGIO DELLE tTg: TEST PIU EFFICACE NELLA DIAGNOSI DI CELIACHIA

35 Conclusioni Immunofluorescenza indiretta:test operatore-dipendente CARATTERIZZATO DA UNA BASSA RIPRODUCIBILITA DISPONIBILITA DI ANTICORPI ANTI ACTINA ISOLATI DA MUCOSA INTESTINALE da utilizzare controllo positivo nei test per il dosaggio degli A.A.A. La Gelsolina sierica è una delle cause pricipali della bassa sensibilità del test

36 Obiettivi futuri: Comprendere i meccanismi patogenetici alla base Comprendere i meccanismi patogenetici alla base dellassociazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitro dellassociazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitro Studi prospettici per comprendere il ruolo predittivo degli A.A.A. in familiari dei soggetti con CMPD Verificare il ruolo degli A.A.A. nella patogenesi del danno intestinale della CD

37 Available online at Clinica Chimica Acta 390 (2008) 134–137 Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease screening Elisa Fabbro Elisa Fabbro, Laura Rubert, Sara Quaglia, Fortunato Ferrara,Valentina Kiren,Tarcisio Not Department of Reproductive and Development Science, University of Trieste and I.R.C.CS Burlo Garofolo Trieste,Italy Received 20 November 2007 ;received in revised form 15 January 2008; accepted 15 January 2008


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