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VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre.

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1 VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre 2004

2 ATTIVITA SVOLTA Determinazione della minima dose efficace, sulla permeabilità epiteliale di nuovi modulatori della via paracellulare Studio della cinetica dazione sulla permeabilità intestinale, di molecole (es. delta-G, esapeptide) in grado di modulare la via paracellulare Verificare la cinetica del transito di macromolecole attraverso la mucosa intestinale resa permeabile dalle molecole sopra descritte.

3 Introduzione La permeabilità intestinale viene solitamente studiata usando il test di assorbimento di 2 zuccheri lattulosio/mannitolo o lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) sono il liquido biologico su cui dosare gli zuccheri. La permeabilità intestinale viene solitamente studiata usando il test di assorbimento di 2 zuccheri lattulosio/mannitolo o lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) sono il liquido biologico su cui dosare gli zuccheri. Sono zuccheri di origine sintetica, non sono presenti nella dieta e non sono metabolizzati dallorganismo. Sono zuccheri di origine sintetica, non sono presenti nella dieta e non sono metabolizzati dallorganismo. Il lattulosio è un disaccaride di PM viene assorbito per via paracellulare mentre il ramnosio è un monosaccaride di PM e viene assorbito per via transcellulare Il lattulosio è un disaccaride di PM viene assorbito per via paracellulare mentre il ramnosio è un monosaccaride di PM e viene assorbito per via transcellulare

4 Epitelio intestinale in condizione normale è impermeabile al lattulosio per la sua dimensione mentre è permeabile al ramnosio Epitelio intestinale in condizione normale è impermeabile al lattulosio per la sua dimensione mentre è permeabile al ramnosio Assorbimento dei due zuccheri risulta alterato se intervengono infezioni batteriche o virali ed in particolari situazioni patologiche (malattia celiaca, morbo di crohn) Assorbimento dei due zuccheri risulta alterato se intervengono infezioni batteriche o virali ed in particolari situazioni patologiche (malattia celiaca, morbo di crohn) Il test si basa sulla somministrazione per via orale dei due zuccheri e sul successivo loro dosaggio sulle urine mediante HPLC Il test si basa sulla somministrazione per via orale dei due zuccheri e sul successivo loro dosaggio sulle urine mediante HPLC

5 SCOPO DELLA RICERCA Semplificare lo studio della permeabilità intestinale mediante test sierologico su goccia di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio. Semplificare lo studio della permeabilità intestinale mediante test sierologico su goccia di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio. Valutare lazione di sostanze capaci di modulare in maniera reversibile la permeabilità della via paracellulare con conseguente variazione nellassorbimento dei due zuccheri. Valutare lazione di sostanze capaci di modulare in maniera reversibile la permeabilità della via paracellulare con conseguente variazione nellassorbimento dei due zuccheri. Dosare questi zuccheri, dopo somministrazione per via orale, su micro campioni di siero (50µl) e confronto con la metodica basata sulla raccolta urine. Dosare questi zuccheri, dopo somministrazione per via orale, su micro campioni di siero (50µl) e confronto con la metodica basata sulla raccolta urine. Per il dosaggio utilizzeremo sempre la metodica HPLC. Per il dosaggio utilizzeremo sempre la metodica HPLC.

6 Caratteristiche strutturali della molecola delta-G utilizzata nel nostro modello sperimentale di permeabilità epiteliale

7 Determinazione della minima dose efficace di ΔG Preparazione della soluzione dei zuccheri con diverse concentrazioni di ΔG 120mg lact + 40mg Rh + 250ng ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 250ng ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 500µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 500µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 1µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 1µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 5µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 5µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 10µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 10µg ΔG in 200µl H2O

8 Prova su topi Prelievo di sangue (circa 100µl) a tempo 0 Prelievo di sangue (circa 100µl) a tempo 0 Somministrazione della soluzione di zuccheri senza e con + ΔG Somministrazione della soluzione di zuccheri senza e con + ΔG Prelievo successivo dopo 1h, Prelievo successivo dopo 1h, Sierare il campione di sangue Sierare il campione di sangue Deproteinizzare il siero Deproteinizzare il siero Marcare il siero con FMOC-Idrazina Marcare il siero con FMOC-Idrazina Dosare gli zuccheri con HPLC Dosare gli zuccheri con HPLC

9 Confronto goccia di sangue con raccolta urine. raccolta urine a tempo zero raccolta urine a tempo zero somministrazione di soluzione degli zuccheri con Delta-G somministrazione di soluzione degli zuccheri con Delta-G raccolta a 5h delle urine (utilizzando gabbia metabolica) raccolta a 5h delle urine (utilizzando gabbia metabolica) filtrare il campione filtrare il campione analisi con HPLC analisi con HPLC

10 Condizioni per il dosaggio degli zuccheri con HPLC Eluenti : A) ACN 25% - H 2 O 75% B) ACN 80% - H 2 O 20% B) ACN 80% - H 2 O 20% Colonna : C18, lungh.10cm, Ø3µm, Vol. camp : 5µl flusso : 1ml/min Temp : ambiente Rilevatore : spettrofotometro (λ 270 nm)

11 Cromatogramma di campione di siero in assenza di ΔG lac rh

12 Cromatogramma di campione di siero in presenza di ΔG lac rh

13 Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli zuccheri senza Delta-G animali lattulosio ramnosio L/R topi topi conigli siero conigli siero conigli urine

14 Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli zuccheri con Delta-G animali lattulosio ramnosio L/R topi conigli siero conigli urine

15 STUDIO DELLA CINETICA Prelievo di sangue a tempo zero Prelievo di sangue a tempo zero Somnistrazione della soluzione dei zuccheri contenente 10µg di ΔG Somnistrazione della soluzione dei zuccheri contenente 10µg di ΔG Prelievo successivo dopo 1h, 6h Prelievo successivo dopo 1h, 6h Somnistrazione della soluzione dei zuccheri senza ΔG Somnistrazione della soluzione dei zuccheri senza ΔG Prelivo successivo dopo 7h, 9h, 11h Prelivo successivo dopo 7h, 9h, 11h

16 DIAGRAMMA DELLA CINETICA

17 RISULTATI Aumento della concentrazione di lattulosio in presenza di ΔG quindi: Aumento della concentrazione di lattulosio in presenza di ΔG quindi: Evidente attività biologica da parte di ΔG sulle giunzioni serrate Evidente attività biologica da parte di ΔG sulle giunzioni serrate La sua attività biologica permane 6h dalla sua somministrazione per os La sua attività biologica permane 6h dalla sua somministrazione per os

18 OBIETTIVI FUTURI Continuare lo studio della cinetica per un tempo prolungato (almeno fino 24 ore) Continuare lo studio della cinetica per un tempo prolungato (almeno fino 24 ore) Utilizzare queste molecole per permettere lassorbimento di farmaci e peptidi attraverso la via paracellulare Utilizzare queste molecole per permettere lassorbimento di farmaci e peptidi attraverso la via paracellulare


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