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TRANSGENESI IN M. musculus Creazione di animali geneticamente modificati per: - conferma di gene candidato responsabile patologia umana - studio della.

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Presentazione sul tema: "TRANSGENESI IN M. musculus Creazione di animali geneticamente modificati per: - conferma di gene candidato responsabile patologia umana - studio della."— Transcript della presentazione:

1 TRANSGENESI IN M. musculus Creazione di animali geneticamente modificati per: - conferma di gene candidato responsabile patologia umana - studio della funzione e della regolazione genica - modelli animali per lo studio delle malattie umane - modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (rescue fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica Un organismo si considera transgenico quando il gene esterno è: integrato nel suo genoma; espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale; integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dallanimale fondatore alla progenie.

2 TRANSGENESI IN M. musculus KNOCK IN Introduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo. Linserzione di un gene esogeno può contemporaneamente determinare linattivazione del gene endogeno attraverso il suo inserimento. KNOCK OUT Introduzione di sequenza genica per labolizione della funzione genica endogena

3 METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 3) Metodi: - Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato - Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. -Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti 4) Tipi di inserzione: - ectopica - mirata 1) Trasferimento genico diretto: -Trasfezione DNA libero con microiniezione 2) Trasferimento tramite vettori (adenovirus, virus adeno associati, retrovirus): infezione virale TRANSGENESI IN M. musculus

4 Inserzione ectopica: effetto di posizione Influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori) Influenza struttura cromatina (eterocromatina, DNA ipermetilato) Controllo di espressione del transgene Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40) per geni sempre attivi e molto espressi Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente Inserzione mirata Inserimento nel genoma in una posizione occupata da sequenza omologa

5 TRANSGENESI IN M. musculus - Gene da esprimere fuso con cDNA proteina GFP - Gene da esprimere fuso con peptidi target di anticorpi fluorescenti.

6 DNA esogeno DNA genomico Produzione di organismo Knock-in o Knock-out per ricombinazione omologa

7 Produzione di organismo Knock-out per ricombinazione

8 Produzione di organismo Knock-out/in per ricombinazione

9 Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Accoppiate con maschi vasectomizzati Oocita fecondato

10 Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Si microiniettano molti oociti

11 Trasferimento genico tramite trasferimento nucleare Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà lintero sviluppo fecondato

12 Metodi per produzione di topi transgenici - Microiniezione nel pronucleo: se linserimento riesce, tutto lanimale che ne deriva è transgenico (comprese cellule germinali) - Trasferimento nucleare: se linserimento riesce, tutto lanimale che ne deriva è transgenico - Trasfezione (o elettroporazione) di cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti, lanimale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali sono transgenizzate)

13 Mutagenesi di cellule ES NO è una CHIMERA!!! Zigote Mutazione genetica due popolazioni cellulari Mosaico Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari Chimera Zigote 2 (cellule ES)

14 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo KO Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positiva- negativa con G418 e ganciclovir Vettore con: gene tk (timidino-chinasi) (tk+ ) dellHerpes virus (tk HSV), gene della Neomicina resistenza = neo R Gene endogeno inattivato per inserzione mirata del gene neo R Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA

15 G418: analogo della neomicina Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk +, ovvero con il vettore virale inserito Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Gcv Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena rottura DNA Tk HSV Tk mammifero

16 Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

17 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

18 Produzione di topo ko (in omozigosi) successivo a mutazione mirata Aguti Fenotipo ko = Coda arricciata

19 1)Ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali (topo marrone) 2)Selezione con G418 e gancyclovir 3) Iniezione delle cellule transgeniche in una blastocisti e impianto in una madre pseudogravida (topo nero) 4) Progenie chimerica 5) Incrocio di eterozigoti per ottenere topo omozigote CREAZIONE TOPO KnockOut

20 ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI MalattiaGeneMetodo Fibrosi cisticaCFTRInattivazione da inserzione mirata Beta talassemiaBeta globinaInattivazione da inserzione mirata Malattia di GaucherGBAInattivazione da inserzione mirata Sindrome dellX fragile FMR1Inattivazione da inserzione mirata Sindrome da prioni umana PRNPIntegrazione del gene murino mutante della proteina prionica Atassia spinocerebellare I SCA1 (atassina)Integrazione del gene umano espanso

21 I topi sono sempre un buon modello? Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane Topo NOD: diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulino- dipendente umano Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lieve della DMD Modelli per malattie con perdita di funzione: identificazione ortologo e creazione topo knock-out. Produzione di: alleli nulli (assenza completa di funzione), mutazioni leaky, (inattivazione geni con funzione simile) Differenza nel fenotipo possibile per presenza di geni modificatori in differenti ceppi murini Modelli per malattie umane con acquisto di funzione: topo knock-in (es inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse)

22 I topi sono sempre un buon modello? Differenze nelle vie biochimiche Differenze nei percorsi di sviluppo Durata della vita media (esordio tardivo nelluomo) Differenze nel contesto genetico


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