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Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo R [R] R [3R] R R [10R] R R R [30R] R R R R R + tutti i non-specifici rispettivi.

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1 Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo R [R] R [3R] R R [10R] R R R [30R] R R R R R + tutti i non-specifici rispettivi

2 Binding R R R SeparazioneFiltrazione, centrifugazione ligando radioattivo tessuto, membrane R Quantificazione

3 Concentrazione di Farmaco radioattivo Radioattivita legata Radioattivita legata in presenza di 10 µM di farmaco non radioattivo Radioattivo: 100 Ci/mmol 50 µg/tubo Dati sperimentali

4 I due tipi di binding: tipo I e tipo II SaturazioneCompetizione [X*] [3X*] [X*]

5 Protocollo di binding (tipo 2) Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo R [R] R R R R R [R] + F R R R R [R] + 10F [R] +1000F R R R R Non specifico Perche utilizzare questo protocollo???

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7 Esempio di binding (II) CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE Curva di inibizione

8 A* + R ARB + R BR K A = [AR] [A][R] K B = [BR] [B][R] [AR] = K A [A][R][BR] = K B [B][R] R T = [R] + [AR] + [BR] = [R] + K A [A][R] + K B [B][R] = [R](1+ K A [A] + K B [B]) [R] = (1+ K A [A] + K B [B]) RTRT [AR] = K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) [AR] R T K A [A] (1+ K A [A] + K B [B]) =

9 [AR] RT K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) = 0.5 IC 50 Se K A e K B sono uguali: K A = 1 + K B [B]* IC 50 K A = 1 IC 50 - D*

10 Esempio di binding (II) Legame specifico: = 3000 N.S. Legame a 0.1 nM di radioattivo D* = 0. 1 nM IC 50 = 0.2 nM K A = 1 IC 50 - D* DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = Una delle prime formule che abbiamo visto!! Possiamo usare questa formula perché K a = K b

11 Proviamo LNAADP e un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e stato sintetizzato [ 32 P]NAADP ad una attivita specifica di 800 Ci/mmol. Il binding e stato fatto con concentrazione fissa di [ 32 P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP. [NAADP] pM DPM

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13 IC 50 = ( )/2 = 1200 quindi 500 pM Kd = = 450 pM Ka = Legame specifico = = 2400 DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = 2400 RT (50* )*2.2* = (50* )*2.2*10 9 = dpm

14 In laboratorio vi viene chiesto, dietro compenso, di provare due nuovi composti per valutarne laffinita sui recettori muscarinici. Utilizzate 5 nM carbacolo radioattivo (attivita specifica 2 Ci/mmol) Che affinita hanno i due composti nel vostro preparato? In un ultimo esperimento provate A + B (entrambi 10 µM) e misurate 350 DPM legati.Cosa ne potete dedurre? Che altri esperimenti potete disegnare per caratterizzare i due composti?

15 IC 50 = 20 nM IC 50 = 1.5 nM IC 50 = 100 nM K A = 1 IC 50 - D* K A = 1 + K B [B]* IC 50 e la Bmax???????

16 DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = DR = 2450 D* = 5 nM K A = M -1

17 Competizione su due siti (cosa potrebbe succedere)

18 Saturazione su due siti DR D DR

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