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Mutagenesi1. 2 MUTAZIONI SPONTANEE La instabilità strutturale del DNA è una possibile fonte di mutazione spontanea Le forze che stabilizzano la doppia.

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Presentazione sul tema: "Mutagenesi1. 2 MUTAZIONI SPONTANEE La instabilità strutturale del DNA è una possibile fonte di mutazione spontanea Le forze che stabilizzano la doppia."— Transcript della presentazione:

1 mutagenesi1

2 2 MUTAZIONI SPONTANEE La instabilità strutturale del DNA è una possibile fonte di mutazione spontanea Le forze che stabilizzano la doppia elica (legami idrogeno fra basi complementari delle due emieliche, interazioni idrofobiche tra basi contigue della stessa emielica, interazioni elettrostatiche tra gruppi fosforici e istoni) hanno caratteristiche di elasticità e non di staticità I legami idrogeno si rompono e si riformano continuamente e le basi affacciate si avvicinano e si allontanano vibrando: le emieliche sono percorse da movimenti laterali alternati, che riguardano 8-10 basi alla volta, centrifughi e centripeti rispetto allasse centrale Le interazioni idrofobiche fra le basi sovrapposte avvicinano gli anelli fino a portarli alla distanza minima compatibile con i raggi di Van der Waals, compattandoli, per poi allontanarli bruscamente Altre possibili cause di mutazioni spontanee sono: - la rottura del legame fosfodiestere su uno o entrambi i filamenti durante i cicli di condensazione-decondensazione della cromatina - tautomeria cheto-enolica della guanina e della timina e tautomeria amino-imminica della adenina e della citosina (lo stato raro delle basi consente la formazione di coppie di basi proibite A-C e G-T) - errori nellincorporazione di un nucleotide allestremità di un filamento nascente durante la duplicazione del DNA

3 mutagenesi3 Le mutazioni possono riguardare un singolo nucleotide o un breve tratto della sequenza nucleotidica (mutazioni geniche), oppure possono essere più estese e coinvolgere parzialmente o interamente uno o più cromosomi (aberrazioni cromosomiche) A T G G C T T C A T A C C G A A G T Mutazioni per sostituzione (transizione) A T G G T T T C A T A C C A A A G T (trasversione) A T G G A T T C A T A C C T A A G T Mutazioni per inserzione (frameshift +) A T G G G C T T C A T A C C C G A A G T Mutazioni per delezione (frameshift -) A T G C T T C A T A C G A A G T G C Mutazioni per duplicazione A T G G C G G C T T C A T A C C G C C G A A G T Mutazioni per inversione A T T T C G G C A T A A A G C C G T

4 mutagenesi4 Luogo della mutazione Possibili conseguenze sequenza TATA (promotore) impediscono o rendono meno efficiente la trascrizione tripletta TAC impediscono la formazione del complesso dinizio della traduzione triplette codificanti aminoacidi alterano il messaggio o generano un sinonimo (terza lettera del codone) giunzione tra esone e introne alterano il segnale di splicing codoni di terminazione traduzione alterano la cornice di lettura

5 mutagenesi5 MUTAZIONI INDOTTE Mutageni chimici - analoghi delle basi azotate - agenti alchilanti - agenti intercalanti

6 mutagenesi6

7 7 Etilmetansulfonato (addiziona gruppi alchilici) e nitrosoguanidina (addiziona gruppi metilici) ALCHILANTI Alchilazione del O legato al C6 della guanina o al C2 della timina appaiamento errato G – T transizioni: AT – GC e GC – AT

8 mutagenesi8 INTERCALANTI La proflavina e le acridine sono sostanze costituite da tre anelli planari le cui dimensioni sono quasi uguali a quelle di una coppia purina-pirimidina. Si legano al DNA inserendosi tra coppie di basi adiacenti e possono provocare, durante le duplicazione, linserzione o la delezione di un nucleotide

9 mutagenesi9 RADIAZIONI UV e FOTODIMERIZZAZIONE Formazione di fotodimeri pirimidinici DEPURINAZIONE Aflatossina B 1

10 mutagenesi10 OSSIDAZIONE PRODOTTA DA SPECIE REATTIVE DELLOSSIGENO La 8-oxodG può legare la adenina determinando una trasversione GC TA DEAMINAZIONE Luracile lega ladenina determinando transizione GC AT La timina lega ladenina determinando transizione GC AT

11 cancerogenesi11 IL MODELLO A PIU STADI DELLA CANCEROGENESI CHIMICA INIZIAZIONE o TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA: porta ad un danneggiamento irreversibile del genoma nelle cellule indotte PROMOZIONE: porta allespansione per clonazione delle cellule iniziate PROGRESSIONE: porta ad un aumento progressivo ed irreversibile della malignità delle cellule Linterazione del cancerogeno o di un suo metabolita con il DNA può portare a premutazioni La premutazione innesca i meccanismi di riparazione del DNA I danni al DNA che vengono eliminati prima della divisione cellulare non hanno conseguenze Più è lungo il tempo tra due divisioni cellulari, tanto maggiore è la probabilità che vengano eliminati i danni al DNA Il danno diventa irreversibile quando viene fissato da almeno una divisione cellulare

12 cancerogenesi12 Grazie ad un aumento della frequenza delle divisioni cellulari e ad una diminuzione dellapoptosi, dalla cellula iniziata si forma una popolazione cellulare con mutazioni identiche Nelle cellule figlie si evidenzia il fenotipo mutato Contrariamente alliniziazione, la promozione è un processo lungo ma reversibile I promotori agiscono con meccanismi dazione differenti: - possono influenzare le vie cellulari di trasduzione del segnale - possono inibire la comunicazione intercellulare - possono influenzare la crescita cellulare e lapoptosi

13 cancerogenesi13 Induttore : 7,12-DMBA (7,12-dimetilbenzoantracene) Promotore: TPA (12-O-tetradecanoil-forbolo-13-acetato) 1) + + 2) + 3) no 4) + 5) no 6) no 7) no 8) + tempo 1) e 2) La applicazione ripetuta di 7,12-DMBA sulla pelle porta, in modo dose-dipendente, alla formazione di tumori 3) Una dose subcancerogena di 7,12-DMBA non è in grado di provocare tumori 4) Nelle stesse condizioni, il trattamento con TPA porta alla formazione di tumore 5) Linversione dello schema di trattamento non ha effetto 6) Il TPA da solo non ha effetto 7) Aumentando lintervallo di tempo tra le applicazioni di TPA scompare lazione promotrice 8) Si formano tumori anche quando aumenta lintervallo di tempo tra iniziazione e promozione

14 cancerogenesi14 Il passaggio da tumore benigno a tumore maligno è indicato come fase di progressione ed è irreversibile La progressione è caratterizzata dalla comparsa di ulteriori mutazioni nella linea di cellule iniziate che contengono già danni genetici Nella progressione si manifesta una instabilità del genoma che porta ad anomalie cromosomiche Il tumore maligno cresce in modo aggressivo e si spinge negli spazi intercellulari del tessuto circostante (crescita infiltrante o invasiva) Inoltre dal tumore maligno primario si liberano cellule che vengono trasportate dal sangue o dalla linfa ad altri organi (capacità di formare metastasi)

15 cancerogenesi15 Mutazioni a carico di geni codificanti proteine che controllano i processi di crescita e proliferazione cellulare possono determinare linsorgenza di tumori

16 cancerogenesi16 Il gene Ras è situato nel braccio corto del cromosoma 11, locus 11p15.5 Il prodotto dellespressione del gene Ras è una proteina che, nella cellula normale, si comporta come un interruttore molecolare, passando rapidamente da uno stato attivo (on) ad uno inattivo (off). La proteina Ras svolge importanti funzioni nella cellula, in quanto, nello stato on, è in grado di attivare numerose vie di trasduzione del segnale che sono implicate nella regolazione dellespressione genica, nella proliferazione, adesione e motilità cellulare Mutazioni del gene Ras portano alla espressione di una proteina che non è più in grado di passare allo stato inattivo e pertanto, una volta innescato il segnale intracellulare, non è più in grado di spegnerlo In circa il 30% dei tumori solidi delluomo sono state rinvenute mutazioni a carico del gene Ras Carcinoma della vescica: sostituzione gly12val Carcinosarcoma mammario: sostituzione gly12asp Carcinoma polmonare: sostituzione gln61leu Carcinoma renale: sostituzione gln61arg Mutazioni a carico delle triplette che codificano per gli aminoacidi in posizione 12 e 61 sembrano perciò portare con elevata probabilità a trasformazione neoplastica delle cellule interessate

17 cancerogenesi17 11p15.5

18 cancerogenesi18 Mentre il gene Ras è un oncogene, cioè un gene che, qualora subisca una mutazione, può portare a crescita e proliferazione incontrollata della cellula, i geni Rb e p53 vengono definiti oncosoppressori, in quanto, nella cellula normale, sono in grado di impedire la trasformazione neoplastica Il gene Rb è localizzato nel cromosoma 13, loci 13q14.1 e 13q14.2 Il prodotto dellespressione del gene Rb è una proteina (p105, proteina del retinoblastoma) che svolge un ruolo chiave nella transizione G1 / S del ciclo cellulare La p105, nello stato defosforilato, sequestra in una tasca della molecola il fattore di trascrizione E2F, indispensabile per la trascrizione di geni che entrano in gioco durante la duplicazione del DNA La fosforilazione di p105 è sotto il controllo dei complessi ciclina /Cdk e, quando la proteina è fosforilata, libera il fattore E2F che può perciò svolgere la sua funzione

19 cancerogenesi19 13q q14.2

20 cancerogenesi20 Il gene Rb ha una funzione di regolazione negativa della proliferazione cellulare, in quanto inibisce la progressione dalla fase G1 alla fase S Mutazioni a carico del gene Rb che impediscono la sintesi o portano alla sintesi di proteina p105 inattiva determinano una crescita cellulare incontrollata Il retinoblastoma è un tumore infantile della retina determinato dalla mutazione di Rb. Nella forma ereditaria, si sviluppano tumori multipli in entrambi gli occhi, mentre nella forma non ereditaria generalmente è colpito un solo occhio In realtà mutazioni del gene Rb possono essere responsabili di numerosi altri tumori, quali alcuni carcinomi della prostata, carcinomi della vescica, della mammella e del polmone, nonché di osteosarcomi e leucemie Mutazione attivazione di oncogeni induzione del tumore Mutazione inibizione di geni oncosoppressori induzione del tumore Molti tumori causati dalla soppressione della funzione di Rb presentano anche danni a carico del gene p53 Il gene p53 è situato nel cromosoma 17, locus 17p13.1 La proteina p53, espressa da questo gene oncosoppressore, è un fattore di trascrizione che funge da sensore della normale progressione del ciclo cellulare e anche da induttore dellapoptosi In caso di malfunzionamento del ciclo, p53 può indurre il blocco del processo replicativo per consentire il ripristino della normalità. Qualora ciò non avvenga, p53 può indurre lattività di geni che avviano il processo di morte cellulare p53 è il gene che più frequentemente si trova alterato o non espresso nei tumori umani. Nelle cellule trasformate che esprimono la forma mutata, questa è generalmente non funzionale

21 cancerogenesi21 17p13.1

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24 cancerogenesi24 CANCEROGENI CHIMICI COMPOSTI DNA-REATTIVI EPIGENETICI Attivazione Attivazione 1) non interagiscono con indipendenti dipendenti il DNA 1) sono composti elettrofili 2) sono PROMOTORI 2) i cancerogeni attivazione indipendenti sono instabili e difficilmente si accumulano nellambiente 3) i cancerogeni attivazione dipendenti sono più stabili, si possono accumulare nellambiente e necessitano di attivazione metabolica per dare origine al composto cancerogeno finale 4) i cancerogeni DNA-reattivi non hanno una dose soglia per lazione genotossica 5) possono interagire in modo additivo o sinergico 6) sono INDUTTORI

25 teratogenesi25 TERATOGENESI Periodo EMBRIONALE (dal concepimento alla 8° settimana) Periodo FETALE (dalla 8° settimana al termine della gestazione)

26 teratogenesi26 Teratogenesi sperimentale SPECIE ANIMALE Ratto, coniglio, topo DOSAGGIO I° LIVELLO: dose che non produce alterazioni osservabili dello stato di salute nella madre II° LIVELLO: uno o più dosaggi intermedi III° LIVELLO: dose che produce lievi ma chiari effetti tossici nella madre GRUPPI DI CONTROLLO 1° GRUPPO (Controllo negativo): trattamento con veicolo o soluzione fisiologica 2° GRUPPO (Controllo positivo): trattamento con una sostanza sicuramente teratogena VIA DI SOMMINISTRAZIONE La stessa prevista per lesposizione nelluomo PERIODO DI SOMMINISTRAZIONE Durante lintero periodo di organogenesi GIORNO TRATTAMENTO (RATTO)

27 teratogenesi27 RILIEVI ED ESAMI Ogni femmina gravida che presenti minaccia di aborto o di parto prematuro deve essere sacrificata ed esaminata Il sacrificio 1 giorno prima della data prevista per il parto consente di evitare fenomeni di cannibalismo e permette il conteggio dei siti di riassorbimento e dei feti morti E necessario rilevare: - numero di corpi lutei - numero di impianti - numero di riassorbimenti - numero di feti morti - numero di feti vivi - peso e lunghezza (cranio-sacrale) dei feti vivi - anomalie morfologiche dei feti vivi Dopo aver esaminato le eventuali anomalie morfologiche, 2/3 dei feti, scelti in modo casuale, devono essere esaminati per evidenziare la possibile presenza di anomalie scheletriche (colorazione con rosso di alizarina) La restante frazione (1/3) viene sezionata ed esaminata per evidenziare la possibile presenza di anomalie agli organi interni ANALISI DEGLI EFFETTI RITARDATI Per effettuare questo tipo di analisi bisogna consentire alle femmine gravide di partorire e di allevare i piccoli Dopo il periodo di allattamento, i piccoli vengono sottoposti a test di tipo neuromotorio e comportamentale per accertare eventuali anomalie

28 DOSE SOGLIA DL 100 EMBRIOFETALE n° impianti - n° feti vivi PERDITA POST-IMPIANTO (%) = X 100 n° impianti Perdita post-impianto (%) dose (mg/kg/die) SPECIE ISOTRETINOINA PERIODO MALFORMAZIONI DOSE SOGLIA TRATTAMENTO (mg/kg/die) (giorni) Topo craniofacciali Ratto craniofacciali Coniglio scheletriche viscerali, SNC Scimmia palatoschisi Uomo 0,4 variabile craniofacciali cardiovascolari SNC

29 teratogenesi29 TERATOLOGIA COMPORTAMENTALE SVILUPPO DEI RIFLESSI - raddrizzamento (1,8 giorni) - geotassi negativa (4,8 giorni) - evitamento del dirupo (4,8 giorni) - presa palmare (6,3 giorni) - allarme fonico (11,4 giorni) - stimolazione delle vibrisse (12,5 giorni) - raddrizzamento in caduta libera (17,5 giorni) - stimolazione visiva (17,6 giorni) MOVIMENTI SPONTANEI - pivoting (tecnica di deambulazione in cui le zampe anteriori e posteriori si muovono in modo non coordinato) (comparsa 7 giorni) - crawling (movimento di propulsione da parte delle zampe anteriori che fungono da remi) (comparsa 8 giorni) - walking (movimento tipico dellanimale quadrupede) (comparsa 12 giorni) - rearing (sollevamento sulle zampe posteriori) - climbing (arrampicamento) - fuga dalla gabbia


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