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Modelli cellulari Modulo B Dal semplice Al complesso.

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Presentazione sul tema: "Modelli cellulari Modulo B Dal semplice Al complesso."— Transcript della presentazione:

1 Modelli cellulari Modulo B Dal semplice Al complesso

2 La cellula rappresenta il modello sperimentale di elezione del biotecnologo per lo studio di: Struttura e funzione della cellula Meccanismi genetici di base: replicazione e divisione cellulare espressione genica Sviluppo e differenziamento cellulare: fisiologico patologico Modelli animali

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7 Cell division Cytocalasin & actin Cell division Fireworks Epidermoblast division Cell division Fireworks sequel Walking on the dark side Gnam gnam Cell highways Cell truks

8 Tissue culture methods Tissue culture of animal cells Tissue culture media Tissue culture plastic ware

9 Tecniche di analisi Proteine Elettroforesi Immunologiche Proteomiche Acidi nucleici Ibridazione Amplificazione Sequenziamento Funzioni cellulari Trasfezione Interferenza

10 Tecniche di base per lanalisi degli Acidi Nucleici Tecniche di Ibridazione: in vitro (Southern & Northern Blot) in vivo (FISH) Tecniche di Amplificazione: PCR RT-PCR & qRT-PCR Lo scopo di queste tecniche è di caratterizzare il genotipo e/o il profilo di espressione genica Tecniche di sequenziamento: Manuale (Sanger) Automatizzato (ABI) Microarray

11 Tecniche di base per lanalisi delle Proteine Apparato base 2D Elettroforetiche: Isoelectric Focusing (IEF) SDS-PAGE 2D Immunologiche: Immuno-blot Immunofluorescenza Proteomiche: MS

12 Tecniche di base per lanalisi di alcune funzioni cellulari Separazione cellulare: Disgregazione tissutale con collagenasi Ficoll Affinità Crescita e migrazione: Colorazione vitale Incorporazione H 3 -dT FACS

13 Tecniche di base per lanalisi di alcune funzioni cellulari Trasfezione: Transiente Stabile Interferenza: RNAi

14 TRASFEZIONE TRANSIENTE Noselezione neo

15 TRASFEZIONE STABILE Sì selezione

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18 I VETTORI RETROVIRALI Retrovirus: virus a RNA a doppio filamento 5-LTR3-LTRpsi geni per la replicazione LTR (long terminal repeat) (ESSENZIALI); LTR (long terminal repeat) (ESSENZIALI); geni per la replicazione (gag, pol e env) (NON ESSENZIALI); geni per la replicazione (gag, pol e env) (NON ESSENZIALI); psi (per lassemblaggio delle particelle virali) (ESSENZIALI). psi (per lassemblaggio delle particelle virali) (ESSENZIALI). I vettori retrovirali vengono costruiti MANTENENDO le I vettori retrovirali vengono costruiti MANTENENDO le SEQUENZE ESSENZIALI, LTR e psi, del genoma retrovirale. SEQUENZE ESSENZIALI, LTR e psi, del genoma retrovirale. Sono vettori SHUTTLE. Sono vettori SHUTTLE. INFEZIONE VIRALE: lRNA è COPIATO in DNA dalla trascriptasi inversa (contenuta nel virione) il DNA inversa (contenuta nel virione) il DNA CIRCOLARIZZA e si INTEGRA nel DNA della CIRCOLARIZZA e si INTEGRA nel DNA della cellula ospite per azione dellintegrasi cellula ospite per azione dellintegrasi (contenuta nel virione). (contenuta nel virione).

19 1. Il costrutto è utilizzato per TRASFETTARE una specifica linea cellulare (cellule helper) una specifica linea cellulare (cellule helper) che contiene, integrati nel genoma i geni che contiene, integrati nel genoma i geni gag, pol e env richiesti per la produzione gag, pol e env richiesti per la produzione del virus. Le cellule trasfettate SONO IN del virus. Le cellule trasfettate SONO IN GRADO di produrre particelle virali contenenti GRADO di produrre particelle virali contenenti UNA COPIA AD RNA DEL COSTRUTTO. UNA COPIA AD RNA DEL COSTRUTTO. 2. Queste particelle virali sono in grado di INFETTARE altre cellule (cellule target) che INFETTARE altre cellule (cellule target) che NON contengono i GENI gag, pol e env. Dal NON contengono i GENI gag, pol e env. Dal momento che le particelle virali CONTENGONO momento che le particelle virali CONTENGONO la TRASCRITTASI INVERSA e lINTEGRASI la TRASCRITTASI INVERSA e lINTEGRASI preformate, in queste cellule lRNA viene preformate, in queste cellule lRNA viene copiato in DNA a doppio filamento che poi si copiato in DNA a doppio filamento che poi si INTEGRA nel genoma della cellula infettata. INTEGRA nel genoma della cellula infettata. Dal momento che queste cellule NON Dal momento che queste cellule NON POSSIEDONO I GENI essenziali PER LA POSSIEDONO I GENI essenziali PER LA REPLICAZIONE VIRALE, NON si REPLICAZIONE VIRALE, NON si VERIFICHERA ulteriore PRODUZIONE di VERIFICHERA ulteriore PRODUZIONE di particelle virali. particelle virali.

20 Come funziona la RNAi

21 HUVEC Human Umbelical Vein Endothelial Cells NHLF Normal Human Lung Fibroblasts Human Hepatocytes Normal Human Epidermal Keratinocytes

22 Linee cellulari tumorali Tumor lines

23 MODELLI ANIMALI IN BIOLOGIA InvertebratiVertebrati Caenorabditis elegans Drosophila melanogaster Danio rerio (zebrafish) RattoTopo Xenopus

24 CARATTERISTICHE GENERALI DI ZEBRAFISH Piccolo pesce osseo d acqua dolce originario del fiume Gange Si nutre di piccoli invertebrati ed è predato da pesci, anfibi, uccelli e mammiferi Ciclo vitale molto rapido (da uovo ad adulto fertile in 7 giorni) La femmina depone un centinaio di uova alla volta con una frequenza settimanale Fecondazione e sviluppo avvengono esternamente Genoma di 1,8 x 10 9 bp organizzato in 25 cromosomi

25 ZEBRAFISH COME MODELLO ANIMALE Vantaggi economici Facili da reperire Basso costo Poco esigenti Allevabili in piccoli acquari Facili da riprodurre in cattività Vantaggi biologici Filogeneticamente più vicini alluomo rispetto ai modelli invertebrati Facili da ibridare Grande quantità di embrioni a disposizione Sviluppo molto rapido Embrioni trasparenti durante tutto lo sviluppo Deposizione delle uova controllabile con lesposizione alla luce Facili da manipolare

26 Possibilità di clonare individui da cellule somatiche Svantaggi Filogeneticamente meno vicini alluomo rispetto a topi e ratti Genoma meno conosciuto rispetto ad altri modelli In conclusione OTTIMO MODELLO ANIMALE PER STUDI SULLA BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

27 SVILUPPO EMBRIONALE DI ZEBRAFISH

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29 METODI DI STUDIO 1) Marcatura con sostanze fluorescenti Per seguire, tramite osservazione al microscopio, la migrazione di singole cellule o di piccoli gruppi durante lorganogenesi 2) Delezione (o innesto) di singole cellule nelle prime fasi dello sviluppo Consente di capire limportanza relativa di una singola cellula nello sviluppo di un dato organo o tessuto Normale sviluppo Sviluppo alterato

30 3) Mutagenesi del maschio Consente di selezionare mutanti per un determinato carattere, come presupposto per studi a livello molecolare

31 4) Aploide ginecogenico UV uova sperma embrioni aploidi

32 5) Soppressione dellespressione di una proteina con antisense morpholino oligonucleotides (M.O.) A A A A A A -3 7mG5- M.O. mRNA A A A A A A -3 7mG5- dsRNA (intraducibile) (della proteina X)

33 Alcuni studi condotti su zebrafish Studi sullo sviluppo dellocchio e delle sue componenti (retina,coni, bastoncelli, cristallino, nervo ottico) es1: studio del mutante belladonna Retina in zebrafish wild-typeRetina nel mutante belladonna es2: importanza del fattore trascrizionale Rx3 nello sviluppo dellocchio attraverso lo studio di mutanti chk

34 Studio dell organogenesi (apparato digerente, cardiovascolare, ecc..) es:importanza del fattore trascrizionale Ptf1a-p48 nello sviluppo del pancreas Studi sullo sviluppo del sistema nervoso es1: espressione di beta1 tubulina nel SN dellembrione e nelladulto es2: espressione dei geni drd3 per il recettore D3 per la dopamina, e drd2a, b e c per i recettori D2 per la dopamina Studi sullo sviluppo embrionale delle gonadi es: importanza della chemochina SDF-1 nellindurre la migrazione delle cellule progenitrici delle gonadi Studi sullimportanza delle adesioni cellulari durante lo sviluppo embrionale es1: espressione di caderina E es2: espressione di connessina 48.5 Studi sulla teratogenicità di sostanze capaci di inquinare le acque es: pesticidi come il sodio metame


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