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MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE
“CLASSICHE E MOLECOLARI”
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Diversità morfologica dei microrganismi
MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO
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Diversità morfologica dei microrganismi
Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula Monotrico Anfitrico Flagello/i non visibile al microscopio!!! Lofotrico Peritrico MORFOLOGIA CELLULARE
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Microscopia ottica ed elettronica
MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici
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Microscopia ottica ed elettronica
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Microscopia ottica ed elettronica
Fonte luminosa Campione Obiettivo Oculare Fascio di elettroni Lente magnetica Lente obiettivo Lente proiettore Immagine schermo fluorescente Microscopia ottica Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
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Microscopia ottica ed elettronica
Concetti chiave Ingrandimento 2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. - occhio umano m - microscopio ottico: 0.2 m (200 nm) - microscopio elettronico: nm Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce-fascio di elettroni)
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Schema: microscopio composto
OCULARE- GENERALMENTE BINOCULARE !! Tubo metallico Ruota obiettivi Braccio OBIETTIVO 10X OBIETTIVO 40X OBIETTIVO 100X Tavolino Porta campione Vite macrometrica Vite micrometrica MESSA A FUOCO Ganci Condensatore Diaframma Sorgente di luce Base microscopio
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Principi di base: microscopio composto
Sistema di lenti convergenti: Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm) Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed ingrandita - Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale, capovolta ed ingrandita
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Principi di base: microscopio composto
10X oculare 10X, 40X,100X obiettivi INGRANDIMENTO FISSO Ingrandimento totale= Ingr. oculare X Ingr. obiettivo OBIETTIVO ED OCULARE LAVORANO INSIEME PER RISOLVERE L’IMMAGINE L’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obbiettivo
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Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione
- L’obiettivo 100X è sempre ad immersione L’obiettivo 100X è retrattatile - L’olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dell’obiettivo
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Microscopio composto: campo chiaro- scuro e a contrasto di fase
CAMPO CHIARO: più comune, basata sulla proprietà della celluna di assorbire o disperdere la luce. Illuminazione dal basso ( condensatore). Colorazione generalmente necessaria 2. CAMPO SCURO: ideale per l’osservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori “falsi”. 3. CONTRASTO DI FASE : aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la differenza di “ritardo” della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per l’osservazione di campioni in vivo. Campo scuro Contrasto di fase
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Osservazione in vivo e le colorazioni
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto - vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto 2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità per specifiche componenti cellulari. Distinguiamo : A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e polisaccaridi acidi, COO-] : blu di metilene, safranina e cristal violetto B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture cellulari citoplasmatiche]. Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.
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Colorazione di Gram 1884 Hans Christian Gram Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare
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Colorazione di Gram Asciugare all’aria Fissare alla fiamma RISULTATO AL MICROSCOPIO?
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Colorazione di Gram Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?
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Colorazione di Gram
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…“ma…” La colorazione di GRAM è molto utilizzata in microbiologia clinica, ma poco sfruttabile in microbiologia ambientale
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Microscopia ad epifluorescenza
SYBR-GREEN Labels double DNA strain DAPI A simple-to-use fluorescent stain, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture at time zero. Upper panel magnification was × , lower panel magnification was ×.
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COLTURE DI MICRORGANISMI
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto. Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.
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Colture di microrganismi
RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.
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MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
solido liquido
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TERRENI DI COLTURA Terreni sintetici o definiti : COMPOSIZIONE ESATTA Terreni complessi : COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc… Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi, nucleotidim vitamine Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali per il metabolismo cellulare. Terreni selettivi Terreni differenziali Terreni di arricchimento
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MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. MEZZI (TERRENI) DI COLTURA The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but does not ferment mannitol. Esempio di Terreno selettivo: MANNITOL SALT AGAR Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;
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TERRENO DI COLTURA: differenziale
Sodium Chloride 5.0gm Sodium Acetate 2.0gm Monoammonium Phosphate 1.0gm Dipotassium Phosphate Magnesium Sulfate 0.1gm Bromothymol Blue 0.08gm Agar 20.0gm Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C. Shigella flexneri Inibito dall’ acetato. Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi . 24h a 35 °C Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi. 24 h at 35°C
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Diversità morfologica dei microrganismi
DIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIE IMPORTANZA DEI PIGMENTI E DEI MARGINI DELLE COLONIE
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PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE
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Test biochimici identificativi
DIVERSITà METABOLICA DALLA COLONIA Test biochimici identificativi
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DIVERSITà METABOLICA
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LA COLONNA DI WINOGRADSKY
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Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce
SCHEMA di una colonna Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce
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PAROLA CHIAVE: GRADIENTE
- DI OSSIGENO DI LUCE DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)
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CONTA DEI MICRORGANISMI
A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10-2 dilution. This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10-7, 10-8, and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.
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CONTA DEI MICRORGANISMI
DAPI, syber green, arancio di acridini Sono colaranti utilizzati anche nella conta di microganismi mediante Microscopia a fluorescenza
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MISURA DELL’ATTIVITà DEI MICROORGANISMI
RESPIRAZIONE Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added through the CO2 absorber in the tube on top of the main flask. During incubation the CO2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube. This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO2 More air can be added and the alkali replaced to continue the process of analysis.
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MISURA DELL’ATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI
AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI
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METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI
Ricavano energia dall’ossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio CH4 + 2 O > CO2 + 2 H2O + energy enzima chiave metano-ossigenasi
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16S RNA RIBOSOMIALE Struttura primaria e secondaria dell’ rRNA 16S di E.coli
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PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE
CFU_ colony-forming unit Unità formante colonia Biolog_example of commercial kit PLFA: phospholipids fatty acid profile FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique IS-PCR Intergenic Spacer- Polymerase Chain reaction
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PLFA: phospholipids fatty acid profile
PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms
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REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
reazione di polimerizzazione a catena Esempi di utilità della PCR : Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie, genere,,etcc (microbiologia clinica) Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente oligotrofico)
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REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
COMPONENTI TEMPERATURA
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REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
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ELETTROFORESI AGAROSIO PERCENTUALE dipendente dalla lunghezza del frammento da caricare EBOLLIZIONE (microonde) PREPARAZIONE Cassetta “versamento”del gel nella cassetta
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ELETTROFORESI CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer) CORSA TRA ELETTRODI
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Risultati PCR su gel
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NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO
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NUOVE TECNICHE: molecolari
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Microscopio ad epifluorescenza
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Microscopio ad epifluorescenza
Schema sorgente di luce 1. Globo di quarzo 2. e 3. Catodo e Anodo 4. Camera di combustione (contenente Hg) 5. Arco voltaico 365 nm 404 434 546 577 613 “linee del mercurio”
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“le colorazioni in” Ecologia microbica
colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza d’onda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza [4',6-diamidino-2-phenylindole ] Campione DAPI + Microscopio a fluorescenza
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Microscopio ad epifluorescenza: immagini
SYBR-GREEN DAPI
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Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)
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Microscopio ad epifluorescenza e FISH
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MICROSCOPIO CONFOCALE
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MICROSCOPIO CONFOCALE
Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione. Intensità luminosa Segnale elettrico Digitalizzazione 1 punto = 1 pixel Coerenza-Alta intensità-Unica λ Specchio dicroico
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MICROSCOPIO CONFOCALE
Spostamento verticale della sezione ottica Sovrapposizione singoli piani Ricostruzione 3D
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Microbiologia : analisi delle acque
Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento
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Microbiologia : analisi delle acque
Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici) Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia intestinalis) - Dai risultati delle analisi → Punteggio → Livelli di inquinamento Parametro Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5 100- OD( % sat) >10 <20 <30 <50 >50 BOD5 (O2 mg/L) < 2.5 <4 <8 <15 >15 COD (O2 mg/L) <5 <10 <25 >25 NH4 (N mg/L) <0.03 <0.10 <0.50 <1.5 >1.5 NO3 (N mg/L) <0.3 <5.0 <10.0 > 10 P (mg/L) <0.07 <0.15 <0.6 >0.6 Escherichia coli (UFC/100 ml) <100 >1.000 < 5.000 <20.000 > Punteggio 80 40 20 10 5
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Microbiologia : analisi delle acque
Conta dei coliformi totali (UFC/ml) Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) Conta delgi Streptococchi fecali TERRENO DI COLTURA T° INC. TEMPO INC. CONTA BATTERICA TOTALE PCA (Plate Agar Count) 22°C 36°C 72h 48h COLIFORMI TOTALI Membrane endo agar less 36°C 24h COLIFORMI FECALI Membrane faecal coliform 44°C STREPTOCOCCHI FECALI KF streptococcus 48h
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Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si “cercano”
“Coliforme”: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae. Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti “Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp. Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro Escherichia coli….
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Microbiologia : Coliformi fecali
Sinonimo di Coliformi termoresistenti Fermentano il lattosio a °C
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Microbiologia : Streptococchi fecali
- Gram positivi Indicatori di inquinamento non recente (vita media>) Terreno KF Sodio azide (inibitore di altri microrganismi) Colonie rosse con alone chiaro attorno
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Microbiologia : Streptococchi fecali
Chi sono e come si “cercano” Species Colonia rossa Alone giallo Enterococcus faecalis + Enterococcus hirae + (poor) Enterococcus equinus Streptococcus pyogenes - Streptococcus agalactiae Lactobacillus plantarum Escherichia coli Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa
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(N colonie contate/ volume campione filtrato) *100
Microbiologia : metodo delle membrane filtranti Metodo delle membrane filtranti N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100
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