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MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE CLASSICHE E MOLECOLARI.

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Presentazione sul tema: "MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE CLASSICHE E MOLECOLARI."— Transcript della presentazione:

1 MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE CLASSICHE E MOLECOLARI

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3 Diversità morfologica dei microrganismi MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO

4 Monotrico Anfitrico Lofotrico Peritrico Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula Flagello/i non visibile al microscopio!!! Diversità morfologica dei microrganismi MORFOLOGIA CELLULARE

5 Microscopia ottica ed elettronica MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate allosservazione di organismi microscopici

6 Microscopia ottica ed elettronica

7 Fonte luminosa Campione Obiettivo Oculare Fascio di elettroni Campione Lente magnetica Lente obiettivo Lente proiettore Immagine schermo fluorescente Microscopia ottica Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

8 Concetti chiave 1.Ingrandimento 2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. - occhio umano m - microscopio ottico: 0.2 m (200 nm) - microscopio elettronico: nm Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce- fascio di elettroni) Microscopia ottica ed elettronica

9 Schema: microscopio composto Tubo metallico OCULARE- GENERALMENTE BINOCULARE !! OBIETTIVO 10X OBIETTIVO 40X OBIETTIVO 100X Ganci Condensatore Diaframma Sorgente di luce Braccio Tavolino Porta campione Vite macrometrica Vite micrometrica MESSA A FUOCO Base microscopio Ruota obiettivi

10 Principi di base: microscopio composto Sistema di lenti convergenti: 1.Oculare ed 2. Obiettivo allestremità di un tubo metallico (160 mm) -Campione (oggetto) davanti l obiettivo immagine reale-capovolta ed ingrandita - Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti alloculare immagine virtuale, capovolta ed ingrandita

11 Principi di base: microscopio composto OBIETTIVO ED OCULARE LAVORANO INSIEME PER RISOLVERE LIMMAGINE Loculare risolve limmagine reale risolta dallobbiettivo 10X oculare 10X, 40X,100X obiettivi INGRANDIMENTO FISSO Ingrandimento totale= Ingr. oculare X Ingr. obiettivo

12 Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione - Lobiettivo 100X è sempre ad immersione - Lobiettivo 100X è retrattatile - Lolio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dellobiettivo

13 Microscopio composto: campo chiaro- scuro e a contrasto di fase 1.CAMPO CHIARO: più comune, basata sulla proprietà della celluna di assorbire o disperdere la luce. Illuminazione dal basso ( condensatore). Colorazione generalmente necessaria 2. CAMPO SCURO: ideale per losservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori falsi. 3. CONTRASTO DI FASE : aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la differenza di ritardo della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per losservazione di campioni in vivo. Campo scuro Contrasto di fase

14 Osservazione in vivo e le colorazioni 1.Osservazione in vivo: - vetrino + goccia campione+ coprioggetto - vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto - vetrino + goccia campione+ coprioggetto 2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità per specifiche componenti cellulari. Distinguiamo : A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e polisaccaridi acidi, COO - ] : blu di metilene, safranina e cristal violetto B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture cellulari citoplasmatiche]. Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.

15 Colorazione di Gram 1884 Hans Christian Gram -Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare

16 Colorazione di Gram Asciugare allaria Fissare alla fiamma RISULTATO AL MICROSCOPIO?

17 Colorazione di Gram Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?

18 Colorazione di Gram

19 …ma… La colorazione di GRAM è molto utilizzata in microbiologia clinica, ma poco sfruttabile in microbiologia ambientale

20 Microscopia ad epifluorescenza DAPI SYBR-GREEN Labels double DNA strain A simple-to-use fluorescent stain, 4',6- diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. (a)and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom (b) culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture (c)at time zero. Upper panel magnification was ×, lower panel (d) magnification was ×.

21 COLTURE DI MICRORGANISMI La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto. Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

22 Colture di microrganismi RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE DELLAMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE, LATTIVITà ANCHE AL FINE PER APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.

23 MEZZI (TERRENI) DI COLTURA solidoliquido

24 TERRENI DI COLTURA Terreni sintetici o definiti : COMPOSIZIONE ESATTA Terreni complessi : COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc… Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi, nucleotidim vitamine Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali per il metabolismo cellulare. Terreni selettivi Terreni differenziali Terreni di arricchimento

25 MEZZI (TERRENI) DI COLTURA The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but does not ferment mannitol. Esempio di Terreno selettivo: MANNITOL SALT AGAR Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;

26 TERRENO DI COLTURA: differenziale Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi. 24 h at 35°C Shigella flexneri Inibito dall acetato. Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi. 24h a 35 °C Sodium Chloride5.0gm Sodium Acetate2.0gm Monoammonium Phosphate 1.0gm Dipotassium Phosphate 1.0gm Magnesium Sulfate0.1gm Bromothymol Blue0.08gm Agar20.0gm Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.

27 Diversità morfologica dei microrganismi DIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIE IMPORTANZA DEI PIGMENTI E DEI MARGINI DELLE COLONIE

28 PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE

29 DIVERSITà METABOLICA DALLA COLONIA Test biochimici identificativi

30 DIVERSITà METABOLICA

31 LA COLONNA DI WINOGRADSKY

32 SCHEMA di una colonna Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce

33 PAROLA CHIAVE: GRADIENTE - DI OSSIGENO - DI LUCE - DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)

34 CONTA DEI MICRORGANISMI A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the dilution. This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10 -7, 10 -8, and dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.

35 CONTA DEI MICRORGANISMI DAPI, syber green, arancio di acridini Sono colaranti utilizzati anche nella conta di microganismi mediante Microscopia a fluorescenza

36 MISURA DELLATTIVITà DEI MICROORGANISMI RESPIRAZIONE Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added through the CO 2 absorber in the tube on top of the main flask. During incubation the CO 2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube. This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO 2 More air can be added and the alkali replaced to continue the process of analysis.

37 MISURA DELLATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI

38 METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI -Ricavano energia dallossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio CH O > CO H 2 O + energy - enzima chiave metano-ossigenasi

39 Struttura primaria e secondaria dell rRNA 16S di E.coli 16S RNA RIBOSOMIALE

40 PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE CFU_ colony- forming unit Unità formante colonia Biolog_example of commercial kit PLFA: phospholipids fatty acid profile FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique IS-PCR Intergenic Spacer- Polymerase Chain reaction

41 PLFA: phospholipids fatty acid profile PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms

42 reazione di polimerizzazione a catena REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR) Esempi di utilità della PCR : 1.Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie, genere,,etcc (microbiologia clinica) 2.Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente oligotrofico)

43 COMPONENTI TEMPERATURA REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)

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45 AGAROSIO PERCENTUALE dipendente dalla lunghezza del frammento da caricare EBOLLIZIONE (microonde) PREPARAZIONE Cassetta versamentodel gel nella cassetta ELETTROFORESI

46 CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer) CORSA TRA ELETTRODI

47 Risultati PCR su gel

48 NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO

49 NUOVE TECNICHE: molecolari

50 Microscopio ad epifluorescenza

51 Schema sorgente di luce 1. Globo di quarzo 2. e 3. Catodo e Anodo 4. Camera di combustione (contenente Hg) 5. Arco voltaico 365 nm linee del mercurio

52 colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza donda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza [4',6-diamidino-2-phenylindole ] CampioneDAPI + Microscopio a fluorescenza le colorazioni in Ecologia microbica

53 Microscopio ad epifluorescenza: immagini DAPI SYBR-GREEN

54 Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

55 Microscopio ad epifluorescenza e FISH

56 MICROSCOPIO CONFOCALE

57 Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione. Intensità luminosa Segnale elettrico Digitalizzazione 1 punto = 1 pixel Specchio dicroico Coerenza-Alta intensità-Unica λ

58 MICROSCOPIO CONFOCALE Spostamento verticale della sezione ottica Sovrapposizione singoli pianiRicostruzione 3D

59 Microbiologia : analisi delle acque - Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento

60 - Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici) - Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia intestinalis) - Dai risultati delle analisi Punteggio Livelli di inquinamento ParametroLivello 1Livello 2Livello 3Livello 4Livello OD( % sat) >10<20<30<50>50 BOD 5 (O 2 mg/L) < 2.5<4<8<15>15 COD (O 2 mg/L) <5<10<15<25>25 NH 4 (N mg/L)<0.03<0.10<0.50<1.5>1.5 NO 3 (N mg/L)<0.3<1.5<5.0<10.0> 10 P (mg/L)<0.07<0.15<0.3<0.6>0.6 Escherichia coli (UFC/100 ml) <100>1.000< 5.000<20.000> Punteggio Microbiologia : analisi delle acque

61 - Conta dei coliformi totali (UFC/ml) - Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) - Conta delgi Streptococchi fecali TERRENO DI COLTURA T° INC.TEMPO INC. CONTA BATTERICA TOTALE PCA (Plate Agar Count) 22°C 36°C 72h 48h COLIFORMI TOTALI Membrane endo agar less 36°C24h COLIFORMI FECALI Membrane faecal coliform 44°C24h STREPTOCOCCHI FECALI KF streptococcus36°C48h

62 Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si cercano -Coliforme: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae. - Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti -Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni - Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp. -Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro - Escherichia coli….

63 Microbiologia : Coliformi fecali - Sinonimo di Coliformi termoresistenti - Fermentano il lattosio a °C

64 Microbiologia : Streptococchi fecali - Gram positivi - Indicatori di inquinamento non recente (vita media>) - Terreno KF - Sodio azide (inibitore di altri microrganismi) - Colonie rosse con alone chiaro attorno

65 Microbiologia : Streptococchi fecali - Chi sono e come si cercano SpeciesColonia rossaAlone giallo Enterococcus faecalis ++ Enterococcus hirae + (poor)+ Enterococcus equinus + (poor)+ Streptococcus pyogenes -- Streptococcus agalactiae-- Lactobacillus plantarum -- Escherichia coli Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa

66 Microbiologia : metodo delle membrane filtranti Metodo delle membrane filtranti N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100


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