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PCR Prof. Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

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Presentazione sul tema: "PCR Prof. Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)"— Transcript della presentazione:

1 PCR Prof. Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

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3 *Primo ormone umano ricombinante (insulina) *Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione *Identificato lAIDS *Prodotto il depakene (epilessia) *Prima bambina in provetta (Luise) *Appare sul mercato lApple Computer ed i floppy disk Prima diagnosi molecolare sul DNA 1978

4 Comera lanalisi genetica prima della PCR? Il Southern blotting (1975) permetteva unanalisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni & delezioni) Il Southern blotting (1975) permetteva unanalisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni & delezioni) Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva che I geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva che I geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato

5 Restriction Enzymes cut in different ways:

6 Linvenzione della PCR Ideata da Kary Mullis nel 1983 Ideata da Kary Mullis nel 1983 La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 Premio Nobel per la chimica nel 1995 Premio Nobel per la chimica nel 1995

7 Descritta la reazione di PCR Parte il progetto genoma umano Costo giornale £ 650 Tazzina Caffè £

8 Polymerase Chain Reaction - PCR La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle tecniche di manipolazione del DNA E essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA PCRamplificazione DNA (singola molecola) Moltemolecole

9 Polymerase Chain Reaction Metodo per lamplificazione esponenziale di sequenze di DNA Metodo per lamplificazione esponenziale di sequenze di DNA Ingredienti di base Ingredienti di base Stampo di DNA o RNA Stampo di DNA o RNA 2 primers complementari a differenti regioni dello stampo 2 primers complementari a differenti regioni dello stampo DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile 4 nucleotidi 4 nucleotidi il buffer appropriato il buffer appropriato

10 Schema della PCR DNA RNA DNA Estrazione del DNA o DNA o RNA dal campione Rivelazione Amplificazione Reverse transcription

11 COMPONENTEVOLUMEConcentrazione finale 10 X PCR Buffer 5l1X 10 X dNTPs (2mM) 5l 200M Forward primer (5 pmols/l) 5l 0.5M Reverse primer (5 pmols/l) 5l 0.5M (25pmols/50l) DNA genomico stampo 2l 1g polimerasi termostabile (5U/l) 0.2l 1 unità H 2 O (a 50l di volume finale) 27.8l TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50 l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml)

12 I cicli della PCR 30–35 cicli ciascuno comprendente: 30–35 cicli ciascuno comprendente: denaturazione (95°C), sec denaturazione (95°C), sec annealing (50–65°C), sec annealing (50–65°C), sec polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento

13 Thermal cycler, AppliedBiosystems

14 Thermal Cyclers, MJ Research

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16 Tutti I blocchi sono uguali ma alcuni sono più uguali di altri! Taken from -

17 Synthesis by DNA polymerase Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * TACGTA ACG-T-T 53 Uno specifico DNA a singola elica (primer o innesco) ibrida con lelica che deve essere copiata

18 Come funziona la PCR Come fa la polimerasi a sapere quando fermarsi una volta che ha raggiunto laltro primer? Come fa la polimerasi a sapere quando fermarsi una volta che ha raggiunto laltro primer? PCR animation alla Dolan DNA Learning Center, CSHL, Cold Spring Harbor PCR animation alla Dolan DNA Learning Center, CSHL, Cold Spring Harbor PCR animation PCR animation

19 Quanto è potente la PCR? La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore Lo stampo di DNA non necessita di particolari purificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp) Lo stampo di DNA non necessita di particolari purificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp) Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo) La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo)

20 Elettroforesi su gel : Separa le molecule per dimensione separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente

21 Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA

22 Il DNA colorato con bromuro di etidio emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se sottoposto a luce UV

23 THE GENOMIC SEQUENCE THE GENOMIC SEQUENCE Fifty years after the double helix, the reference DNA sequence of Homo sapiens is now available for downloading. Annotation of genes and other features is in progress. Fifty years after the double helix, the reference DNA sequence of Homo sapiens is now available for downloading. Annotation of genes and other features is in progress. Download Sequence Data Download Sequence DataDownload Sequence Data Download Sequence Data

24 Screenshot from University of California at Santa Cruz PTEN gene UCSC Genome Browser on Human July 2003 Freeze

25 Mutation screening from genomic DNA

26 Mutation screening from RNA by RT-PCR

27 Quante copie? Nessun prodotto fino al 3° ciclo Nessun prodotto fino al 3° ciclo Laccumulazione non è un raddoppiamento completo dopo ciascun ciclo Laccumulazione non è un raddoppiamento completo dopo ciascun ciclo Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza definita (~ ) Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza definita (~ )

28 How Big A Target? Amplification products are typically in the size range bp. Amplification products are typically in the size range bp. Longer targets are amplifiable >25 kb. Longer targets are amplifiable >25 kb. Requires modified reaction buffer, cocktails of polymerases, and longer extension times. Requires modified reaction buffer, cocktails of polymerases, and longer extension times. Limited by the integrity of the starting target DNA > 50 kb. Limited by the integrity of the starting target DNA > 50 kb.

29 Designing PCR Primers Primers should be ~20 bases long. Primers should be ~20 bases long. The G/C content should be 45–55%. The G/C content should be 45–55%. The annealing temperatures should be within 1°C of one another. The annealing temperatures should be within 1°C of one another. The 3´-most base should be a G or C. The 3´-most base should be a G or C. The primers must not base pair with each other or with themselves or form hairpins. The primers must not base pair with each other or with themselves or form hairpins. Primers must avoid repetitive DNA regions. Primers must avoid repetitive DNA regions.

30 Primers That Form Dimers A primer may form a dimer with itself or with the other primer. A primer may form a dimer with itself or with the other primer. 5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ 5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ |||||||||| |||||||||| 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase. Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.

31 Primers That Form Hairpins A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin: A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin: 5´-GTTGACTTGATA 5´-GTTGACTTGATA ||||| T ||||| T 3´-GAACTCT 3´-GAACTCT The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA. The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.

32 Optimising the PCR Reaction Annealing temperature of the primers. Annealing temperature of the primers. The concentration of Mg 2+ in the reaction. The concentration of Mg 2+ in the reaction. The extension time. The extension time. (The denaturing and annealing times.) (The denaturing and annealing times.) (The extension temperature.) (The extension temperature.) (The amount of template and polymerase more is less.) (The amount of template and polymerase more is less.)

33 Optimising the Annealing Temperature Primers have a calculated annealing temperature (e.g. 54°C). Primers have a calculated annealing temperature (e.g. 54°C). Temperature must be confirmed practically. Temperature must be confirmed practically. Temperature steps of 2°C above and below. Temperature steps of 2°C above and below. Use gradient cycler. Use gradient cycler.

34 Optimising the Mg 2+ Concentration The fidelity of the PCR depends on [Mg 2+ ]. The fidelity of the PCR depends on [Mg 2+ ]. Vary [Mg 2+ ] in steps of 0.5 mM. Vary [Mg 2+ ] in steps of 0.5 mM. Sometimes a compromise between yield and specificity. Sometimes a compromise between yield and specificity.

35 ADDITIVi? DMSO Formamide Glicerolo QIAGEN – Q Stratagene - Perfect Match

36 Nested PCR

37 False positive PCR Contamination Contamination at the time of specimen collection at the time of specimen collection during transport during transport in the laboratory from other patient samples or positive control material in the laboratory from other patient samples or positive control material negative controls used to detect contamination negative controls used to detect contamination Primers are not specific enough Primers are not specific enough do additional confirmatory tests do additional confirmatory tests PCR for other targets, additional tests to confirm the identity of the product PCR for other targets, additional tests to confirm the identity of the product

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39 General applications of PCR (1)

40 General applications of PCR (2)

41 Restriction site polymorphism analysis by PCR

42 Genotyping

43 Allele-specific PCR

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45 Fidelity of the Reaction Taq DNA polymerase lacks the 3´ 5´ proof-reading activity commonly present in other polymerases. Taq DNA polymerase lacks the 3´ 5´ proof-reading activity commonly present in other polymerases. Taq mis-incorporates 1 base in Taq mis-incorporates 1 base in A 400 bp target will contain an error in 33% of molecules after 20 cycles. A 400 bp target will contain an error in 33% of molecules after 20 cycles. Error distribution will be random. Error distribution will be random.

46 Do Errors Matter? Yes, if you want to clone the amplified DNA an individual molecule may harbour several mutations. Yes, if you want to clone the amplified DNA an individual molecule may harbour several mutations. No, if you want to sequence the amplified DNA or cut it with restriction enzymes. No, if you want to sequence the amplified DNA or cut it with restriction enzymes. Use a proof-reading thermo-stable enzyme rather than Taq. Use a proof-reading thermo-stable enzyme rather than Taq.

47 Cloning PCR Products Products should be ligatable into blunt- ended restriction enzyme site. Products should be ligatable into blunt- ended restriction enzyme site. Lower than expected efficiency. Lower than expected efficiency. Products are not truly blunt-ended. Products are not truly blunt-ended. Taq polymerase adds a single non- templated base (usually A) to the 3´ end: Taq polymerase adds a single non- templated base (usually A) to the 3´ end: NNNNNNN…NNNNNNNA ANNNNNNN…NNNNNNN NNNNNNN…NNNNNNNA ANNNNNNN…NNNNNNN

48 Cloning of PCR products

49 Can I PCR Amplify RNA? Not directly the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. Not directly the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase. mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase. cDNA is a template for PCR it need not be double-stranded. cDNA is a template for PCR it need not be double-stranded.

50 Multiplex PCR PCR reactions can be devised in which several targets are amplified simultaneously often used in diagnostic applications. PCR reactions can be devised in which several targets are amplified simultaneously often used in diagnostic applications.

51 Sequencing PCR products

52 Automated DNA sequencing


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