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Biofisica Lanalisi informatica per la comprensione della struttura e funzione delle proteine: le SIMULAZIONI AL CALCOLATORE Di che cosa trattiamo ? Alcuni.

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Presentazione sul tema: "Biofisica Lanalisi informatica per la comprensione della struttura e funzione delle proteine: le SIMULAZIONI AL CALCOLATORE Di che cosa trattiamo ? Alcuni."— Transcript della presentazione:

1 Biofisica Lanalisi informatica per la comprensione della struttura e funzione delle proteine: le SIMULAZIONI AL CALCOLATORE Di che cosa trattiamo ? Alcuni cenni sulla struttura delle PROTEINE

2 Biofisica La struttura delle biomolecole è un argomento di grande interesse per molti settori della ricerca di base e applicativa STRUTTURA FunzioneMeccanismoOrigine/Evoluzione

3 Biofisica La FISICA fornisce metodi computazionali e approcci sperimentali molto potenti per indagare la struttura delle macromolecole biologiche.

4 Biofisica Le più importanti tecniche sperimentali e teoriche per lanalisi delle strutture di macromolecole Microscopie Simulazioni al computer di dinamiche molecolare e interazioni molecolari Spettroscopie Difrattometria ai raggi X Modellistica molecolare

5 Biofisica Le proteine e gli acidi nucleici sono polimeri Le macromolecole sono costruite collegando insieme unità strutturali definite MONOMERI Proteine 20 amminoacidi 4 basi nucleotidiche Acidi nucleici

6 Biofisica LE PROTEINE (dal greco protos: principale) SONO LE MACROMOLECOLE PIU ABBONDANTI E SVOLGONO SVARIATE FUNZIONI, ad es.: La proteina cheratina è il componente strutturale dei capelli, squame, corna, lana, unghie etc. La luce prodotta dalle lucciole coinvolge la proteina luciferina; Gli eritrociti contengono la proteina emoglobina che trasporta lossigeno;

7 Biofisica Contengono 20 amminoacidi uniti tramite un legame peptidicocovalente Il legame peptidico Amminoacido

8 Biofisica La sequenza degli amminoacidi costituisce la struttura primaria Ogni pallina corrisponde ad un amminoacido Ribonucleasi: M r da, 124 aa., secreta dal pancreas. Catalizza lidrolisi di acidi nucleici ingeriti con la dieta

9 Biofisica Le proteine hanno diversi livelli di struttura

10 Biofisica Le principali strutture secondarie di una catena polipetidica: elica… MODELLO A PALLE E BASTONCINI a)Elica destrorsa, b)Si evidenziano i legami idrogeno c)Il passo dellelica è 5.4 Å o 3.6 residui amminoacidici

11 Biofisica …e foglietto I legami idrogeno si formano tra segmenti adiacenti I segmenti adiacenti possono anche essere lontani nella sequenza amminoacidica Le catene possono essere parallele o antiparallele

12 Biofisica Classificazione generale delle strutture terziarie Proteine con predominanza di elica Proteine con predominanza di sheets Proteine miste

13 Biofisica La struttura quaternaria riguarda proteine costituite da più catene polipeptidiche o da più domini strutturali (es. proteine regolatrici) Esempio: la emoglobina La struttura quaternaria delle proteine Le interazioni tra le subunità consentono grandi variazioni nellattività catalitica

14 Biofisica Le interazioni non covalenti che partecipano nella definizione della struttura delle biomolecole

15 Biofisica Molte malattie sono dovute al difettoso ripiegamento di una proteina Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson, encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II. In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non raggiungono la loro locazione finale o che non sono più in grado di svolgere la loro funzione perché incapaci di legare i loro substrati. Fibrosi cistica: difetto nella proteina transmembrana che agisce come un canale degli ioni cloro nelle cellule epiteliali (CFTR: 1480 amminoacidi). La mutazione più comune è la delezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge correttamente.

16 Biofisica Il problema del folding: che cosa determina la struttura tridimensionale delle proteine? In genere la sequenza amminoacidica contiene la informazione completa per il raggiungimento della struttura funzionale

17 Biofisica DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE DELLE MACROMOLECOLE BIOLOGICHE A LIVELLO ATOMICO = determinare le coordinate spaziali xyz per ogni singolo atomo, ovvero le posizioni reciproche degli atomi nello spazio

18 Biofisica TECNICHE SPERIMENTALI X-ray crystallography (Kendrew and Perutz ) Diffrazione di raggi X incidenti su cristalli di biomolecole -> dipende dalla spaziatura tra gli atomi NMR spectroscopy (Ernst and Wuthrich ) Assorbimento di radio frequenze da parte di biomolecole (solo certi tipi di nuclei) IN SOLUZIONE e immerse in un campo magnetico -> dipende dallintorno del nucleo

19 Biofisica NMR Raggi X Con NMR si ottengono delle famiglie di strutture: si hanno informazioni sulla mobilità delle porzioni di macromolecola, ma in molti casi il risultato finale è molto simile Mioglobina Confronto NMR - diffrazione ai raggi X

20 Biofisica TECNICHE COMPUTAZIONALI Lutilizzo COMPLEMENTARE di tecniche di tipo sperimentale e di tipo computazionale è lapproccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi biologici. I limiti delluna sono infatti superati dallaltra

21 Biofisica Limiti delle tecniche sperimentali risoluzione SPAZIALE misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi risoluzione ENERGETICA analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa risoluzione TEMPORALE i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione

22 Biofisica Limiti delle tecniche computazionali Sistemi biomolecolari troppo complessi si devono utilizzare approssimazioni Simulazione del comportamento nel tempo di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (

23 Biofisica Scala dei tempi e delle distanze per una proteina Å s Movimenti locali: fluttuazioni atomiche movimenti delle catene laterali movimenti dei loops Å s Movimenti di corpo rigido: movimento delle eliche movimento dei domini (piegamento degli hinge loops) movimento delle subunità > 5 Å s Movimenti su larga scala: transizioni elica - coil dissociazione/associazione folding e unfolding

24 Biofisica Alcune Applicazioni MODELLIZZARE la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola

25 Biofisica Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.

26 Biofisica Studiare le VARIAZIONI CONFORMAZIONALI provocate dallinterazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce lattivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).

27 Biofisica Monitorare i CAMBIAMENTI STRUTTURALI indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.

28 Biofisica Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.

29 Biofisica Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita unindicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio dazione.

30 Biofisica

31 Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) Linformazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dellenergia libera della proteina

32 Biofisica Sequenze casuali non sono in grado di ripiegarsi in maniera univoca Esse sono una piccola famiglia di sequenze selezionate dalla natura attraverso levoluzione. Ciascuna ha un minimo globale distinto, ben separato dagli altri stati metastabili. Quali sono le proprietà uniche e comuni a tutti gli elementi di questo particolare insieme di sequenze di tipo proteico? Le proteine presenti in natura non sono sequenze casuali.

33 Biofisica Diagramma di flusso della modellizzazione proteica Sequenza proteica Proteina omologa nella banca dati PDB? Predizione della struttura secondaria Allineamento delle strutture secondarie Predizione della struttura terziaria Modellizzazione comparativa Dati sperimentali Assegnazione dei domini Allineamento multiplo di sequenza Predizione del fold E stato predetto un fold? Analisi della famiglia del fold Ricerca nelle banchedati No Sì No Allineamento della sequenza alla struttura Modello tridimensionale della proteina

34 Biofisica che viene usata come STAMPO. Permette di costruire la struttura tridimensionale di una proteina sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con unaltra proteina di struttura NOTA

35 Biofisica Si basa sulle seguenti osservazioni: le proteine appartengono ad un numero limitato di famiglie strutturali proteine della stessa famiglia hanno strutture tridimensionali molto simili

36 Biofisica E molto importante lallineamento di sequenza con la proteina stampo * aa identici. aa simili

37 Biofisica Dopodichè si procede con… …la costruzione dello scheletro… …linserimento delle catene laterali… …linserimento dei loop corrispondenti a buchi nellallineamento…

38 Biofisica …lottimizzazione del modello.. …e il controllo della sua qualità …per concludere con…

39 Biofisica HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) […]

40 Biofisica ATOM 1 N VAL A N ATOM 2 CA VAL A C ATOM 3 C VAL A C ATOM 4 O VAL A O ATOM 5 CB VAL A C ATOM 6 CG1 VAL A C ATOM 7 CG2 VAL A C ATOM 8 N LEU A N ATOM 9 CA LEU A C ATOM 10 C LEU A C ATOM 11 O LEU A O ATOM 12 CB LEU A C ATOM 13 CG LEU A C ATOM 14 CD1 LEU A C ATOM 15 CD2 LEU A C ATOM 16 N SER A N ATOM 17 CA SER A C ATOM 18 C SER A C ATOM 19 O SER A O ATOM 20 CB SER A C ATOM 21 OG SER A O … XYZ coordinate tipo di atomo tipo di amminoacido

41 Biofisica 1a3n Deossiemoglobina catena A C O N S EME Fe

42 Biofisica RASMOL v 2.7

43 Biofisica e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING). Comprende tecniche come: la RICERCA DEL MINIMO DELLENERGIA CONFORMAZIONALE, la DINAMICA MOLECOLARE,

44 Biofisica Nucleo ed elettroni sono «ammassati» in una sola particella atomo-simile. Tali particelle atomo-simili sono sferiche e possiedono una carica. Le interazioni sono basate sui potenziali delle molle e sui potenziali classici. Le interazioni sono parametrizzate per specifici set di atomi. Le interazioni determinano la DISTRIBUZIONE SPAZIALE delle particelle atomo-simili e la loro ENERGIA. Assunzioni fondamentali

45 Biofisica Ad ogni conformazione molecolare è associata una ENERGIA POTENZIALE

46 Biofisica La forma più semplice DELLENERGIA POTENZIALE di una molecola è : ENERGIA pot = Energia di ALLUNGAMENTO dei legami + Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame + Energia di TORSIONE degli angoli diedri + Energia delle interazioni di NON- LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche bending stretching torsion

47 Biofisica Forma matematica più comune: |-Energia di allungamento-|| Energia di piegamento | | Energia torsionale || Energia di non-legame |

48 Biofisica Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando il minor numero di calcoli possibile.

49 Biofisica Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) Linformazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dellenergia libera della proteina

50 Biofisica Termodinamica del folding visto come imbuto di energia libera Si raggiunge il minimo energetico assoluto percorrendo anche strade diverse Ogni minimo relativo corrisponde a stati intermedi metastabili Le interazioni idrofobiche di residui non polari provocano ilcollasso idrofobico Scendendo verso il basso si ha una diminuzione delle specie

51 Biofisica Strategie di ricerca del minimo assoluto Esistono metodi computazionali di ricerca del minimo assoluto che implicano il campionamento dello spazio conformazionale: -il campionamento energetico sistematico -lannealing simulato -la ricerca casuale enorme onere computazionale utilizzabili solo per peptidi corti

52 Biofisica Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio: stabilità delle proteine variazioni conformazionali folding proteico trasporto ionico

53 Biofisica Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le accelerazioni degli atomi della molecola. La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell equazione del moto di Newton F i = m i a i per tutti gli atomi del sistema molecolare

54 Biofisica 3. delle accelerazioni : sono determinate da una relazione che lega la forza che agisce su un atomo all'energia potenziale. Per calcolare una traiettoria c'è bisogno: 1. delle posizioni inziali r i : si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling; 2. delle velocità iniziali v i : si ottengono dalla distribuzione delle velocità alla temperatura assegnata;

55 Biofisica In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti t. t tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari una simulazione di 100 ps coinvolge intervalli di integrazione.

56 Biofisica Struttura iniziale rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole dacqua per equilibrarlo con la struttura la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia Fase di simulazione vera e propria Minimizzazione dell energia Solvatazione della proteina Minimizzazione dell energia in presenza del solvente Fase di riscaldamento Fase di equilibrazione si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata. Protocollo di simulazione

57 Biofisica Analisi dei risultati Campionamento periodico di coordinate (e velocità) Calcolo dellenergia potenziale media in funzione del tempo Calcolo della differenza con la struttura di partenza in funzione del tempo Calcolo della superficie accessibile al solvente e del raggio di girazione, in funzione del tempo Calcolo della struttura media

58 Biofisica Riconoscimento molecolare E il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)

59 Biofisica La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante allinterno dei processi biologici.

60 Biofisica La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals) sommati ad interazioni favorevoli (es. idrofobiche). Gli atomi del sito di legame forniscono limpalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato contorno e particolari proprietà chimiche Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore

61 Biofisica Metodi computazionali per la predizione della struttura 3D di complessi proteina-ligando. Insieme di tecniche che consentono di simulare interazioni tra vari sistemi (sito attivo di un enzima e una nuova molecola di inibitore) e di valutare approssimativamente le nuove interazioni che si creano. docking

62 Biofisica In questultimo caso, viene trovato il corretto modo di legame di un composto tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano lenergia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore. Tali funzioni valutano fattori quali: Complementarità fra superficie Interazioni elettrostatiche e idrofobiche Energia libera di solvatazione

63 Biofisica AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, GRID… Algoritmi di docking. Posizionano ligandi - rigidi o flessibili - in siti di binding proteici generalmente rigidi. algoritmi Prendendo in considerazione anche la flessibilità del recettore allora andrebbero considerati centinaia o anche migliaia di gradi di libertà. Il ligando durante il binding cambia la sua struttura tridimensionale in termini di angoli di torsione per trovare il miglior adattamento spaziale ed energetico nel sito di binding della proteina. Questa assunzione segue il modello chiave-serratura citato in precedenza.

64 Biofisica Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività farmaci

65 Biofisica 1.Ricerca del composto guida (1-2 anni) 2.Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni) 3.Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni) 4.Test tossicologici (1-3 anni) 5.Test per la sicurezza sulluomo (1 anno) 6.Test per lefficacia sulluomo (1-2 anni) tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco è di grande importanza lidentificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni Costo totale: circa $

66 Biofisica Screening sperimentale: test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore Metodi computazionali detti Rational Design: si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando

67 Biofisica Metodi computazionali Struttura 3D del recettore NON notaStruttura 3D del recettore nota Structure Based Drug Design QSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship) Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e lattività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dallanalisi delle similitudini e differenze strutturali con composti noti, fornendo anche informazioni sui requisiti strutturali del recettore. De Novo Design I nuovi composti vengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici. Screening Virtuale Librerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame Docking

68 Biofisica

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70 Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per: la modellazione di sistemi proteici la comprensione dei processi biologici la comprensione della relazione struttura-attività la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali


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