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Biofisica fisica24ore Il file PDB HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN;

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Biofisica fisica24ore Il file PDB HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN;

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1 Biofisica fisica24ore Il file PDB HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) […]

2 Biofisica fisica24ore ATOM 1 N VAL A N ATOM 2 CA VAL A C ATOM 3 C VAL A C ATOM 4 O VAL A O ATOM 5 CB VAL A C ATOM 6 CG1 VAL A C ATOM 7 CG2 VAL A C ATOM 8 N LEU A N ATOM 9 CA LEU A C ATOM 10 C LEU A C ATOM 11 O LEU A O ATOM 12 CB LEU A C ATOM 13 CG LEU A C ATOM 14 CD1 LEU A C ATOM 15 CD2 LEU A C ATOM 16 N SER A N ATOM 17 CA SER A C ATOM 18 C SER A C ATOM 19 O SER A O ATOM 20 CB SER A C ATOM 21 OG SER A O … XYZ coordinate tipo di atomo tipo di amminoacido

3 Biofisica fisica24ore 1a3n catena A C O N S EME Fe

4 Biofisica fisica24ore RASMOL v 2.7

5 Biofisica fisica24ore Tecniche computazionali Lutilizzo complementare di tecniche di tipo sperimentale e di tipo computazionale è lapproccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi biologici. Questa considerazione riguarda in particolare gli aspetti strutturali del problema, ovvero la conoscenza della conformazione, o variazione di conformazione, di una molecola biologica in relazione alla sua attività.

6 Biofisica fisica24ore Limiti delle tecniche sperimentali risoluzione spaziale misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi risoluzione energetica analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa risoluzione temporale i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione

7 Biofisica fisica24ore Limiti delle tecniche computazionali Sistemi biomolecolari troppo complessi meccanica classica con funzioni di interazione semi-empiriche per descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema molecolare Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di una macromolecola utilizzo dei dati sperimentali per restringerlo Simulazione del comportamento di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (

8 Biofisica fisica24ore importanza della COMPLEMENTARITA DELLAPPROCCIO TEORICO- SPERIMENTALE

9 Biofisica fisica24ore Scala dei tempi e delle distanze per una proteina Å s Movimenti locali: fluttuazioni atomiche movimenti delle catene laterali movimenti dei loops Å s Movimenti di corpo rigido: movimento delle eliche movimento dei domini (piegamento degli hinge loops) movimento delle subunità > 5 Å s Movimenti su larga scala: transizioni elica - coil dissociazione/associazione folding e unfolding

10 Biofisica fisica24ore Alcune Applicazioni In primis: conoscere la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola per comprendere, spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la sua attività biologica.

11 Biofisica fisica24ore Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.

12 Biofisica fisica24ore Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.

13 Biofisica fisica24ore Studiare le variazioni conformazionali provocate dallinterazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce lattivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).

14 Biofisica fisica24ore Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.

15 Biofisica fisica24ore Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita unindicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio dazione.

16 Biofisica fisica24ore Modellizzazione molecolare

17 Biofisica fisica24ore Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) Linformazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dellenergia libera della proteina

18 Biofisica fisica24ore Diagramma di flusso della modellizzazione proteica Sequenza proteica Allineamento multiplo di sequenza Dati sperimentali Ricerca nelle banchedati Assegnazione dei domini Proteina omologa nella banca dati PDB? E stato predetto un fold? Predizione del fold Predizione della struttura secondaria Analisi della famiglia del fold Allineamento delle strutture secondarie Allineamento della sequenza alla struttura Predizione della struttura terziaria Modellizzazione comparativa Modello tridimensionale della proteina No Sì No

19 Biofisica fisica24ore che viene usata come STAMPO. Permette di costruire la struttura tridimensionale di una proteina sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con unaltra proteina di struttura NOTA

20 Biofisica fisica24ore 1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e stampo Passi fondamentali * aa identici. aa simili

21 Biofisica fisica24ore 2. Costruzione dello scheletro

22 Biofisica fisica24ore 3. Inserimento delle catene laterali

23 Biofisica fisica24ore 4. Inserimento dei loop corrispondenti a buchi nellallineamento

24 Biofisica fisica24ore 5. Ottimizzazione del modello Minimizzazione energetica Regolarizzazione di legami, angoli e torsioni Eliminazioni di clash strutturali

25 Biofisica fisica24ore 6. Controllo della qualità del modello

26 Biofisica fisica24ore Meccanica molecolare e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING). Comprende la DINAMICA MOLECOLARE, la RICERCA DELLENERGIA CONFORMAZIONALE,

27 Biofisica fisica24ore Nucleo ed elettroni sono «ammassati» in una sola particella atomo-simile. Tali particelle atomo-simili sono sferiche e possiedono una carica. Le interazioni sono basate sui potenziali delle molle e sui potenziali classici. Le interazioni devono essere pre-attribuite a specifici set di atomi. Le interazioni determinano la DISTRIBUZIONE SPAZIALE delle particelle atomo-simili e la loro ENERGIA. Asssunzioni fondamentali

28 Biofisica fisica24ore Ad ogni conformazione molecolare è associata unENERGIA

29 Biofisica fisica24ore La forma più semplice dellenergia potenziale di una molecola è : ENERGIA pot = Energia di ALLUNGAMENTO dei legami + Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame + Energia di TORSIONE degli angoli diedri + Energia delle interazioni di NON- LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami come molle. Forma equazione + parametri = force field

30 Biofisica fisica24ore Forma matematica più comune: |-Energia di allungamento-|| Energia di piegamento | | Energia torsionale || Energia di non-legame |

31 Biofisica fisica24ore Ricerca dellenergia conformazionale Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) Linformazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dellenergia libera della proteina

32 Biofisica fisica24ore La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema della ricerca del minimo assoluto)

33 Biofisica fisica24ore Conformazione energeticamente preferita minimo globale dell'energia potenzialeequilibriostato più popolatorisultante delle forze nulla

34 Biofisica fisica24ore Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando il minor numero di calcoli possibile. Minimizzazione dellenergia

35 Biofisica fisica24ore Campionamento energetico sistematico : Lenergia viene campionata ad intervalli regolari sullintera estensione di ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami).

36 Biofisica fisica24ore Annealing simulato: riscaldamento ad alta temperatura che modifica la struttura superando le barriere energetiche, seguito da un raffreddamento lento.

37 Biofisica fisica24ore Dinamica molecolare: superamento delle barriere energetiche conformazionali (più basse dell'annealing) e analisi della stabilità strutturale. Ricerca casuale: campionamento che genera strutture in maniera casuale, le quali vengono poi minimizzate

38 Biofisica fisica24ore Dinamica molecolare Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio: stabilità delle proteine variazioni conformazionali folding proteico trasporto ionico

39 Biofisica fisica24ore Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le accelerazioni degli atomi della molecola.

40 Biofisica fisica24ore La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell equazione del moto di Newton F i = m i a i per tutti gli atomi del sistema molecolare Tenendo presente che la forza si può esprimere come gradiente dell'energia potenziale: F i = - dV/dr i si combinano le due equazioni e si ottiene: - dV/dr i = m i d 2 r i /dt 2 che collega la derivata dell'energia potenziale alle variazioni di posizione in funzione del tempo ed è quella che viene integrata.

41 Biofisica fisica24ore 3. le accelerazioni sono determinate dal gradiente dell'energia potenziale. Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno: 1.delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate atomiche) 2.delle velocità iniziali 3.delle accelerazioni 1. le posizioni inziali r i si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling; 2. le velocità iniziali v i si ottengono dalla distribuzione delle velocità ad una data temperatura;

42 Biofisica fisica24ore In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti t. t tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari una simulazione di 100 ps coinvolge intervalli di integrazione. Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano le posizioni e le velocità a tutti gli altri tempi t.

43 Biofisica fisica24ore Sistema allo zero assoluto Temperatura di simulazione desiderata Riscaldamento lento alla temperatura di simulazioneRiequilibrazione dellenergia tra gli atomiDistribuzione iniziale di velocità v i Energia cinetica totale del sistema

44 Biofisica fisica24ore Struttura iniziale rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole dacqua per equilibrarlo con la struttura la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia Fase di simulazione vera e propria Minimizzazione dell energia Solvatazione della proteina Minimizzazione dell energia in presenza del solvente Fase di riscaldamento Fase di equilibrazione si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata.

45 Biofisica fisica24ore Analisi dei risultati Campionamento periodico di coordinate (e velocità) Calcolo dellenergia potenziale media in funzione del tempo Calcolo della differenza con la struttura di partenza in funzione del tempo Calcolo della superficie accessibile al solvente e del raggio di girazione, in funzione del tempo Calcolo della struttura media

46 Biofisica fisica24ore Riconoscimento molecolare E il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)

47 Biofisica fisica24ore La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante allinterno dei processi biologici.

48 Biofisica fisica24ore Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività

49 Biofisica fisica24ore 1.Ricerca del composto guida (1-2 anni) 2.Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni) 3.Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni) 4.Test tossicologici (1-3 anni) 5.Test per la sicurezza sulluomo (1 anno) 6.Test per lefficacia sulluomo (1-2 anni) tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco è di grande importanza lidentificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni Costo totale: circa $

50 Biofisica fisica24ore Screening sperimentale: test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore Metodi computazionali detti Rational Design: si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando

51 Biofisica fisica24ore Metodi computazionali Struttura 3D del recettore NON notaStruttura 3D del recettore nota Structure Based Drug Design QSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship) Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e lattività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dallanalisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore. De Novo Design I nuovi composti vengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici. Screening Virtuale Librerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame Docking

52 Biofisica fisica24ore Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando. Tali funzioni valutano: Complementarità fra superficie Energia libera di solvatazione Interazioni elettrostatiche e idrofobiche Trova il corretto modo di legame di un composto, tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano lenergia di ogni combinazione confomazionale ligando- recettore.

53 Biofisica fisica24ore

54 Biofisica fisica24ore

55 Biofisica fisica24ore Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per: la modellazione di sistemi proteici la comprensione dei processi biologici la comprensione della relazione struttura-attività la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali


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