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Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme Fai qualcosa di speciale Scatola nera Poi succede qualcosa …….

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Presentazione sul tema: "Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme Fai qualcosa di speciale Scatola nera Poi succede qualcosa ……."— Transcript della presentazione:

1 Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme Fai qualcosa di speciale Scatola nera Poi succede qualcosa …….

2 Trasformazione batterica Uptake of DNA nudo, spesso un plasmide circolare GFP Beta lactamase (ampicillin resistance) pGLO plasmids Bacterial chromosomal DNA Cell wall

3 Metodi di trasformazione Elettroporazione –shock elettrico che rende le membrane cellulari permeabili al DNA(si usa anche per le lellule eucariotiche) Calcio cloruro/Heat Shock –Cellule, rese competenti chimicamente, incorporano DNA nudo dopo heat shock

4 Ruolo del CaCl 2 per rendere le cellule competenti CaCl 2 genera buchi nella membrana dei batteri rendendoli capaci di incorporare DNA

5 Ruolo del CaCl 2 per rendere le cellule competenti- cont Gli ioni of Ca +2 carichi positivamente mascherano le cariche negative dei gruppi fosfato presenti nel DNA Ca ++ O CH 2 O P O O O Base CH 2 O P O O O Base OH Sugar O Ca ++

6 Attenzione!!!! CaCl 2 rende le cellule più fragili Delicatezza (ghiaccio e pipettata gentile)

7 Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme 45 minuti in ghiaccio Il DNA aderisce ai batteri Shock termico 42 °C per 2 min Il DNA entra nei batteri

8 Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico - cont Periodo di recupero a 37 °C in presenza di terreno che permette la replicazione del DNA plasmidico nelle cellule in cui è entrato 1 ora a 37 °C Questo periodo permette alle cellule di esprimere il gene di resistenza all antibiotico (ampicillina) e di potere replicare successivamente sulle piastre

9 Controlli della Trasformazione

10 Spread plate

11

12 Piastre rigorosamente asciutte MAI piastrare più di 300 µl o MENO di 50 µl Raffreddare bene la bacchetta di vetro Lasciare asciugare prima di spostare le piastre Le piastre danno conteggi affidabili solo se il numero di colonie é tra 30 e 500

13 Finalmente…. Se non avete la disponibilità di un incubatore a 37 °C potete lasciare le piastre sul banco. Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.

14 EFFICIENZA DI TRASFORMAZIONE Colony Forming Unit (CFU)/µg DNA Calcolre i µg totali di DNA usati Calcolare il fattore di diluizione della piastratura (se é stata fatta) Contare le colonie Moltiplicare il numero di colonie per la diluizione di piastratura Dividere per i ng di DNA utilizzato Efficienza di trasformazione (CFU/ g)= n°colonie g DNA


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